| Summary: | Resumo: A dengue tornou-se, na última década, a mais importante arbovirose em temos de morbidade e mortalidade, afetando, aproximadamente, 100 milhões de pessoas ao ano. A doença é causada por um vírus de RNA cadeia simples, o qual é transmitido através da picada de mosquitos do gênero Aedes, presentes ao longo de toda a região tropical e subtropical do mundo. Uma vez que não existem vacinas contra a dengue e seus sintomas são semelhantes aos de outras doenças, um método diagnóstico rápido e confiável é fundamental para o controle efetivo de epidemias. Os principais métodos diagnósticos utilizados atualmente são os ensaios imunoenzimáticos de captura de IgM (MAC-ELISA) e a detecção do RNA virai através de RT-PCR. A eficiência dessas duas técnicas, no entanto, é variável e depende da qualidade dos reagentes e do protocolo utilizado. A fim de contribuir para a melhoria das técnicas de diagnóstico atualmente utilizadas no Brasil, desenvolveu-se esse trabalho, cujos principais objetivos foram: 1) obter antígenos específicos e a um baixo custo, capazes de substituir antígenos produzidos em cérebro de camundongo, utilizados em um teste de MAC-ELISA desenvolvido no Brasil; 2) estabelecer um protocolo de PCR em tempo real para detectar o RNA do vírus da dengue em amostras de soro humano, utilizando como protótipo o sorotipo 1 do vírus (DEN1). Os antígenos usados no teste de MAC-ELISA foram produzidos em cultivo celular e foram testados utilizando-se 50 soros de indivíduos suspeitos de infecção por dengue. Os resultados foram comparados com os do teste original. Apenas dois resultados discordantes foram obtidos. A análise dessas duas amostras por uma terceira técnica (dot-blot) confirmou os resultados obtidos com o antígeno feito em cultura, sugerindo que este, além de ser mais facilmente produzido, é mais sensível e específico. Os dois testes sorológicos detectaram um número maior de amostras positivas entre os soros coletados após o sétimo dia de início dos sintomas. O protocolo de PCR em tempo real desenvolvido nesse trabalho foi comparado com um protocolo de nested PCR descrito na literatura. Ambos os testes foram avaliados quanto sua sensibilidade e especificidade utilizando RNA de vírus da dengue dos sorotipos 1 (DEN1) e 2 (DEN2) e de vírus da febre amarela. A nested PCR foi capaz de detectar o RNA proveniente de 2x102 FFU/ml, enquanto que a sensibilidade da PCR em tempo real foi inferior a 6,25x10"1 FFU/ml. A PCR em tempo real para DEN1 não foi capaz de amplificar amostras de DEN2, mas detectou como positivas as amostras de febre amarela, o que não ocorreu na nested PCR. O mesmo painel de soros testado por ELISA foi submetido às duas técnicas de PCR e os resultados obtidos foram comparados. A baixa sensibilidade da nested PCR foi confirmada pela baixa taxa de detecção observada quando RNAs extraídos diretamente dos soros foram usados na reação. Quando os soros foram passados em cultura celular antes da extração do RNA, porém, o número de amostras positivas aumentou consideravelmente, indicando que essa etapa é importante para o melhor funcionamento dessa técnica. A maior sensibilidade da PCR em tempo real parece compensar, no entanto, esse problema. As duas técnicas de PCR detectaram um número maior de amostras positivas entre os soros coletados antes do sétimo dia após o início dos sintomas, indicando que os métodos moleculares são complementares aos testes sorológicos e as duas abordagens devem, portanto, ser utilizadas em conjunto a fim de garantir um diagnóstico preciso. Além disso, os resultados até o momento obtidos sugerem que, devido sua maior sensibilidade e simplicidade, a PCR em tempo real é mais apropriada, do que a nested PCR, para o diagnóstico da dengue.
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