| Summary: | Resumo: O citoesqueleto dos organismos da família Trypanosomatidae é muito pouco estudado. Esta família inclui organismos que causam doenças em humanos, como doença de Chagas e doença do sono – Trypanosoma cruzi e T.brucei, respectivamente – e leishmaniose – causada por diferentes espécies do gênero Leishmania. Microtúbulos são os principais filamentos dos tripanossomatídeos e ainda não foi detectada a presença dos filamentos de actina, embora já tenha sido mostrada a presença desta proteína por imunoensaios. Microtúbulos e filamentos de actina podem funcionar como trilhos para motores moleculares, responsáveis pelo transporte de carga. As miosinas são as proteínas motoras que se movem ao longo dos filamentos de actina e são classificadas de acordo com suas similaridades. Os tripanossomatídeos possuem a miosina de classe I, presente em quase todos os organismos eucarióticos, e uma miosina exclusiva da família, a de classe XIII. A presença desta miosina de tripanossomatídeos é bastante intrigante, principalmente porque pouco se sabe sobre o citoesqueleto de actina destes organismos. Este trabalho visa à caracterização funcional das duas miosinas de T.cruzi comuns aos tripanossomatídeos – myo1 e myo13 – e tem como propostas: verificação da expressão destas proteínas pelo parasita, localização celular e identificação de complexos proteicos ligados às miosinas obtidos por imunoprecipitação, utilizando anticorpos produzidos em camundongos; localização através da expressão da miosina inteira e cauda fusionadas à GFP em T.cruzi; remoção ou inibição da atividade funcional da proteína através de nocaute e ensaio dominante-negativo. Anticorpos foram produzidos em camundongos inoculados com os fragmentos cabeça e cauda das miosinas expressas em E.coli. Os soros produzidos se mostraram específicos para proteínas de tamanho esperado, porém os produzidos contra myo1 reagiram também contra outras bandas. Estes resultados de ligação cruzada podem ser explicados devido à baixa expressão desta proteína pelo parasita, como mostrado em estudos de proteômica e transcriptômica. Resultados de imunofluorescência da myo1 mostraram uma concentração da proteína próxima ao cinetoplasto, podendo ser a bolsa flagelar. Esta localização é semelhante à myo1 de T.brucei, que está envolvida com a endocitose. A imunolocalização realizada com o soro contra a myo13 marcou uma região na base do flagelo, a mesma região da myo13 de L.donovani, que está envolvida na montagem do flagelo. A cauda da myo1-GFP se localizou na mesma região da imunofluorescência, compatível com a bolsa flagelar, indicado que a carga pode ser a responsável pela localização desta miosina. Experimentos estão em andamento para a identificação dos complexos proteicos nos quais as miosinas estão interagindo. A superexpressão da cauda para promoção de um fenótipo dominante negativo não teve efeito morfológico visível a microscópio óptico ou na taxa de replicação de epimastigotas. Estamos trabalhando para a geração de parasitas nocaute. Baseando-se nas localizações e nos trabalhos publicados com T.brucei e L.donovani, sugerimos que a myo1 esteja envolvida com endocitose e tráfego de vesículas, e que a myo13 esteja envolvida com a montagem do flagelo. Assim, com este trabalho, iniciamos a caracterização das miosinas de T.cruzi, o que pode contribuir para um maior conhecimento do processo de transporte intracelular destes parasitas.
|
|---|
