| Summary: | Orientadora : Sheila M. B. Winnischofer === Co-orientadora : Glaucia R. Martinez === Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 11/02/2010 === Bibliografia: 91-103 === Resumo: O melanoma e um tipo de tumor que se origina dos melanocitos, sendo altamente resistente as terapias convencionais, especialmente quando se encontra em condicoes de metastase, o que torna necessario a busca por novas alternativas de tratamento. O processo de metastase, em geral, e facilitado pela acao das metaloproteinases de matriz (MMPs), que degradam a matriz extracelular, favorecendo a invasao. Entre os elementos que podem regular a atividade de MMPs esta RECK, uma glicoproteina ancorada a membrana celular. Tendo em vista que as estatinas sao drogas que inibem a sintese de colesterol e isoprenoides podendo interferir na composicao da membrana das celulas, e tambem que varios trabalhos relatam a acao antitumoral destas drogas, inclusive em linhagens celulares de melanoma, este trabalho avaliou o efeito do tratamento de celulas de melanoma humano (SK-MEL 28) com doses variadas de uma estatina (sinvastatina) em relacao aos niveis de RNAm de RECK (e suas isoformas alternativas de splicing), MMPs e TIMPs e aos processos de proliferacao e viabilidade celular. As analises de viabilidade celular (realizadas pelo metodo de cristal violeta) demonstraram que o tratamento com sinvastatina e capaz de provocar reducao de viabilidade das celulas SK-MEL 28, e que esta reducao e dose e tempo dependente. A analise do ciclo celular (realizada por citometria de fluxo) demonstrou a parada das celulas SK-MEL 28 em G1 com a concomitante diminuicao da quantidade de celulas na fase G2-S e o aumento da porcentagem de celulas na fase Sub-G1, apos 72h de exposicao as diferentes doses de sinvastatina. A analise dos perfis de expressao dos genes de interesse foi investigado atraves de ensaios de PCR quantitativo em Tempo Real. Os resultados indicam que nao ocorre modulacao da expressao da forma canonica de RECK (RECK-A) (tanto de mRNA como de proteina), tampouco das isoformas RECK-D e RECK-I apos o tratamento com o agente antitumoral. Ocorre diminuicao dos niveis de RNAm da isoforma B de RECK, apos o tratamento com 1 e 5ƒÊM de sinvastatina por 72h. Nas mesmas doses de sinvastatina observa-se uma tendencia a diminuicao da expressao de MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP, embora nao seja estatisticamente significativa. Tambem ocorre tendencia a reducao da quantidade de transcrito de TIMP-1, ao passo que ha reducao significativa da expressao de TIMP-2 apos tratamento com 5ƒÊM de sinvastatina. Foi ainda verificado que as razoes entre as expressoes relativas de RECK-A/MMP-2 e RECK-B/MMP-2 aumentam significativamente quando as celulas SK-MEL 28 sao tratadas com 1ƒÊM de sinvastatina por 72h, sugerindo que o deslocamento do balanco proteolitico a favor de RECK pode contribuir para as acoes antitumorais exercidas pela sinvastatina. Nossos dados sugerem, ainda, que RECK-A e RECK-B sejam regulados de maneira distinta nas celulas de melanoma (pelo menos apos o tratamento com sinvastatina) e talvez a maior ou menor atividade de MMPs nas celulas possa ser devido a uma acao conjunta destas duas isoformas de RECK. Estas observacoes corroboram com os dados obtidos nesse trabalho que mostram uma tendencia evidente de diminuicao de expressao de todas as MMPs avaliadas (MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP) apos o tratamento com a droga. === Abstract: Melanoma is a cancer that arises from melanocytes. In its early stages malignant melanoma can be cured by surgical resection, but once it has progressed to the metastatic stage it is extremely difficult to treat and does not respond to current therapies, being necessary the study for new therapeutic approaches to this disease. Matrix metalloproteinases (MMPs) show multiple functions as extracellular/cell surface enzymes, and are broadly recognized for their matrix-degrading ability and involvement in cell motility and invasion. The activity of MMPs is regulated by tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) and RECK (that’s encodes a membrane-anchored protein which suppresses invasion/metastasis by negatively regulating MMP-2, MMP-9 and MT1-MMP). Considering that statins (in addition to downregulating cholesterol levels) exert effects anti-inflammatory and anti-proliferative in several types of tumor cell lines, the main interest of this study was to correlate the action of a statin (specifically: simvastatin) with the modulation of mRNA levels of RECK, its alternative splicing isoforms, MMPs and TIMPs in the melanoma cell line (SK-MEL 28). The cell viability analysis (through crystal violet staining) shows that simvastatin treatment is able to reduction the cell viability in a dose and time dependent way. The effect of the simvastatin treatment in the cell cycle progression of SK-MEL 28 cells was evaluated by flow citometry. Our results show cell arrest in G1, reduction of percentage of cells in the G2-S phase and increased of percentage of cells in the Sub-G1 phase, after simvastatin treatment by 72h. In order to evaluate the molecular mechanism involved in the anti-proliferative effects of simvastatin in melanoma cells, we analyzed the mRNA expression profiles (through quantitative real time RT-PCR assays) of the RECK gene (canonical form and alternative isoforms, namely: RECK B, RECK D and RECK I), MMPs and TIMPs in SK-MEL 28 cells treated with simvastatin at 1ìM and 5ìM for 72h. The results show no modulation of the expression levels of RECK-A, RECK-D and RECK-I after simvastatin treatment. On the other hand, the RECK-B mRNA levels are significantly reduced upon treatment with 1 and 5ìM of simvastatin. The mRNA expression levels of MMP-2, MMP-9, MT1-MMP and TIMP-1 were not significantly altered. We also observed significantly reduced expression of TIMP-2 after treatment with 5ìM of simvastatin. In addition, the expression ratios RECK-A/MMP-2 and RECK-B/MMP-2 are significantly higher upon treatment with 1ìM of simvastatin by 72h. Our results suggest that RECK-B can be modulated in a distinct manner of the canonical form (RECK-A) after simvastatin treatment and, suggest that the control of MMPs activity could involved the synergistic action of both RECK isoforms (RECK-A and RECK-B) and TIMP-2.
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