Clonagem, expressão e caracterização imunológica da proteína Pb40r presente na fração protetora F0 de paracoccidioides brasiliensis

• Main Author: Viviane Cristina Fernandes
• Other Authors: Alfredo Miranda de Goes
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Minas Gerais 2007
• Online Access: http://hdl.handle.net/1843/UCSD-8H6QU3

=== Paracoccidioidomycosis (PCM) is one of the most important endemic mycoses in Latin America; its usually diagnosed by observation and/or isolation of the etiologic agent, Paracoccidioides brasiliensis, as well as by a variety of immunological methods. Although the latter are effective, two circumstances, cross-reactions with other mycotic agents and antigen preparation marked by extreme variability among batches, prevents a proper standardization of the procedures. To overcome this lack of reproducibility, molecular biology tools were used to produce a recombinant 40-kDa-molecular-mass antigen from this fungus. This antigen was identified by Goes et al. (2005), through the AST strategy, as a homolog of Neurospora Crassa calcineurin B. This cDNA was cloned in pGEX4T-3 vector and was expressed in a prokaryotic system as a protein with 378 amino acids and approximately 40 kDa of molecular weight, denominated pb40r. This protein has two EF-hand binding calcium domains and the comparisons of the transcribed sequence to sequences in different gene banks reveal a homology to the EF-HAND domain protein of Neosartorya fischeri and Aspergillus clavatus. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using mice immune serum samples against the recombinant protein, showed that pb40r is an immunogenic protein able to induce the production of a great quantity of IgG, IgG1 and IgG2a antibodies. Moreover, mice infected with P. brasiliensis are also able to recognize pb40r. They showed production of IgG, IgG1 and IgG2a against pb40r. A battery of 149 human serum samples, consisting of 72 sera samples from patients with several clinical forms of PCM, 61 sera sample from patients with diverse infections and 16 from healthy subjects, were all tested by ELISA using the purified pb40r. The sensitivity was 90.3%, when compared to the healthy subjects and the specificity for PCM patients was 81.25% while for patients with other diseases, it was 81.96%. A significant high cross-reaction was detected when sera from patients with leishmaniases was evaluated. These results indicate that the recombinant protein pb40r is a promising antigen to be used in immunodiagnosis of PCM. === Paracoccidioidomicose (PCM) é uma das mais importantes micoses endêmicas da América Latina; ela é usualmente diagnosticada pela observação e/ou isolamento do seu agente etiológico Paracoccidioides brasiliensis, assim como por uma grande variedade de métodos imunológicos. Embora esses últimos sejam efetivos, dois grandes problemas, reação cruzada com outros agentes micóticos e complexidade dos antígenos utilizados, impedem a padronização desses procedimentos. Para superar essa falta de reprodutibilidade, ferramentas de biologia molecular foram utilizadas para produzir um antígeno recombinante, de aproximadamente 40kDa de peso molecular, desse fungo. Esse antígeno foi identificado por Góes e colaboradores (2005), através da estratégia da produção de ASTs, tendo sido caracterizado como uma proteína que apresentou homologia com a calcineurina B de Neurospora crassa. Essa proteína foi clonada em vetor pGEX4T-3 e expressa em sistema procarioto, apresentando-se como uma proteína de 378 aminoácidos e aproximadamente 40kDa, sendo denominada pb40r. Essa proteína possui dois motivos mão-EF de ligação ao cálcio e apresenta homologia com a EF-HAND domain protein de Neosartorya fischeri e de Aspergillus clavatus. Testes de ELISA utilizando soros de camundongos imunizados com a proteína recombinante demonstraram que a mesma é imunogênica, sendo capaz de induzir significativa produção de anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a. Além disso, camundongos infectados com P. brasiliensis também responderam a testes de ELISA, demonstrando a produção de IgG, IgG1 e IgG2a anti-pb40r. Uma bateria de 149 amostras de soro humano, consistindo de 72 de pacientes com PCM de diversas formas clínicas, 61 de pacientes com infecções diversas e 16 de indivíduos aparentemente saudáveis, foram testados por ELISA com a proteína recombinante, pb40r, purificada. A sensitividade e a especificidade da proteína em distinguir indivíduos sem infecção aparente de indivíduos com PCM de diversas formas clínicas foram de 90,3% e 81,25%, respectivamente. Já a especificidade desse antígeno frente a soros de indivíduos com outras infecções foi de 81,96%. Taxa significativa de reatividade cruzada foi observada com soros de pacientes com leishmaniose. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstram que a proteína recombinante pb40r é um antígeno promissor, como alvo para imunodiagnóstico da PCM.