| Summary: | === Cells have evolved a complex set of mechanisms to appropriately respond to genotoxic damage, ensuring genomic stability. Such responses retain mutation rates in an acceptable level, through a fine-tuning balance between genome maintenance and generation of genetic variability. In this work, we studied some features of the DNA repair machinery of Schistosoma mansoni and Trypanosoma cruzi, the causative agents of schistosomiasis and Chagas disease in Brazil. Both parasites need to adapt to distinct environments, and are consequently exposed to various DNA damaging agents. Using a functional heterologue complementation strategy, we have isolated a S. mansoni cDNA that complements Escherichia coli mutants defective in the DNA base excision repair (BER) pathway. This cDNA has sequence homology to a gene involved in the RNA metabolism pathway, the ScIMP4 gene of Saccharomyces cerevisiae. To establish whether the S. mansoni cDNA could complement yeast mutants ScIMP4-defective, we constructed a yeast haploid strain containing a truncated Imp4p gene which shows MMS sensitivity. The functional homology between the ScIMP4 gene and the cDNA from S. mansoni was verified by partial complementation of the mutant yeast with the worms gene. As a second goal, we studied T. cruzi DNA repair mechanisms possibly involved in the generation of genetic variability in this protozoan parasite. We have previously demonstrated that polymorphisms in the TcMSH2 locus, which encodes a key component of the mismatch repair (MMR), result in three different protein isoforms present in the T. cruzi population. Using cisplatin, MNNG and H2O2 in vivo assays performed with cadmium, which in sub lethal concentrations inhibits specifically the MMR, we provided evidences that TcMSH2A-expressing parasites have increased MMR activity when compared to parasite strains expressing TcMSH2C isoforms. To better understand the mechanisms involved in the oxidative DNA damage response in T. cruzi we characterized the putative OGG1 ortologue in the parasite and showed that (i) TcOgg1A expression is toxic in bacteria and (ii) stably TcOgg1A transfected parasites have increased H2O2 sensitivity. Additionally, a search for candidates for a functional homologue of E. coli MutT in T. cruzi using the Nudix Box was attempted. We`ve found that expression of Ndx1 or Ndx4 was unable to suppress the high spontaneous mutagenesis of E. coli mutT-deficient strain and that EcMutT overexpressing parasites showed increased survival and decreased 8oxoG levels after H2O2 treatment. Finally, we developed a methodology to determine the mutation rate in T. cruzi. The assay is performed in semisolid medium plates and is based on the selection of clones that spontaneously reverts the neomycin-sensitive phenotype caused by a single base substitution in the neomycin resistance gene (neo) inserted into the parasite genome. Our preliminary results indicate that this experimental approach is functional since (i) clones that grew in neomycin containing plates have the mutation repaired as shown by DNA sequence, (ii) a proportionally higher number of clones able to grow in the presence of neomycin was observed after long-time culture in liquid medium and in cultures that were treated with a mutagenic agent. This methodology is now in place in our laboratory to be used to determine the mutation rate in distinct T. cruzi strains, as well as analyzing the effect of different mutagens in this parasite. === O conteúdo genético de um organismo está continuamente exposto a agentes que danificam a molécula de DNA, causando mutações ou comprometendo suas funções. Complexos mecanismos de reparo ou tolerância a danos no DNA ajudam a manter baixas as taxas de mutação em uma célula e a garantir a integridade do seu genoma. Neste trabalho, estudamos o reparo de DNA em dois parasitos humanos, Schistosoma mansoni e Trypanosoma cruzi, causadores da esquistossomose e da Doença de Chagas no Brasil. Esses parasitas são expostos a diferentes agentes genotóxicos ao longo do ciclo de vida e necessitam, portanto, apresentar diversos mecanismos de adaptação. Através da estratégia de complementação funcional heteróloga, isolamos um cDNA de S. mansoni capaz de complementar bactérias deficientes na via de reparo por excisão de bases (BER). O sequenciamento do cDNA indicou homologia ao gene ScIMP4 de Saccharomyces cerevisiae, que está envolvido no metabolismo de RNA. Construímos uma linhagem mutante de S. cerevisiae, que codifica a proteína IMP4 truncada e verificamos que esta apresenta sensibilidade acentuada a MMS. Observamos ainda que o gene IMP4 de S. mansoni foi capaz de complementar parcialmente a levedura mutante, indicando homologia funcional entre os genes IMP4 do verme e da levedura. Na segunda etapa deste trabalho, estudamos mecanismos de reparo de DNA possivelmente associados à geração de variabilidade genética em T. cruzi. Nosso grupo demonstrou previamente a existência de três isoformas (A, B e C) da proteína TcMSH2 em T. cruzi. Esta proteína é o principal componente da via de reparo de erros de pareamento (MMR) em eucariotos. Através de ensaios in vivo com cisplatina, MNNG e H2O2, na presença de cloreto de cádmio (em concentrações que inibem especificamente o MMR), obtivemos novos indícios de que as cepas que codificam a isoforma A de TcMSH2 apresentam MMR mais eficiente, quando comparadas a cepas que codificam a isoforma C desta proteína, e isto pode estar relacionado com a maior variabilidade genética vista nas últimas. Para estudar mecanismos de resposta a danos oxidativos em T. cruzi, caracterizamos o possível ortólogo de OGG1 no parasito. Vimos que a expressão do alelo TcOgg1A é tóxica em bactérias e que a superexpressão deste no clone CL Brener aumenta sua sensibilidade ao tratamento com H2O2. Ainda, realizamos uma busca por homólogos funcionais de MutT em T. cruzi. Nossos resultados indicam que os alelos Ndx1 e Ndx4, que apresentam o domínio Nudix, não complementam bactérias deficientes em MutT. Também observamos que a superexpressão de EcMutT em T. cruzi aumenta a sobrevivência dos parasitos em resposta ao tratamento com H2O2 e reduz os níveis de 8-oxoG após estresse oxidativo. Finalmente, desenvolvemos um sistema repórter capaz de avaliar a taxa de mutação em T. cruzi. O ensaio, realizado em meio semi-sólido, baseia-se na seleção de mutantes resistentes a neomicina, que revertem uma mutação inserida no gene neo introduzido no genoma do parasito. Os resultados obtidos em um ensaio preliminar indicam a viabilidade da metodologia, através da qual seremos capazes de determinar a taxa de mutação em diferentes cepas de T. cruzi, assim como avaliar o efeito de diferentes agentes mutagênicos no parasita.
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