Estudos sobre mutação em Trypanosoma cruzi: desenvolvimento de uma nova abordagem metodológica e efeitos do Cádmio

• Main Author: Carolina Furtado Torres da Silva
• Other Authors: Carlos Renato Machado
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Minas Gerais 2005
• Online Access: http://hdl.handle.net/1843/UCSD-8FVNSF

=== The protozoan Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease, a chronic ilness afflicting over 18 million people in Americas (WHO, 2002). Different studies including biological, biochemical and molecular ones have demonstrated that T. cruzi is a very heterogeneous taxon (Macedo et al, 2004). However, it has been proposed that T. cruzi has a clonal population structure in which sexual reproduction is rare or absent (Ayala, 1993). Therefore, we asked how T. cruzi achieves this remarkable heterogeneity among the strains and clones. One could then expect that DNA repair would play a role since the function of mismatch repair (MMR) in decreasing the mutation rate is well understood (Hsieh, 2001). It has been proposed that different T. cruzi strains have different mismatch repair ability under stress conditions and consequently different mutations rates (Augusto-Pinto et al, 2003). In this work, we have carried out studies about mutation in three T. cruzi strains by evaluation of the role of cadmium in causing genomic instability in T. cruzi and investigation of possible differences in mutation rates among strains. Here, we described the development of a new methodology, based on strains carring a mutant gfp allele which codes for an inactive GFP protein, through wich it will be possible to directly determine the mutation rate in T. cruzi through FACS analysis of the fluorescence emitted by cells transfected with gfp. Using the transfected strains, the results indicate that cadmium, in the presence of hydrogen peroxide, induces an increase in mutation rate of the CL Brener and Colombiana strains. We also verified that cadmium inhibits ATP hydrolysis by recombinant TcMSH2 protein. Finally, we investigated the genomic stability of the JG, CL Brener and Colombiana strains treated with cadmium and hydrogen peroxide for different period of time (30 to 60 days) through analysis of two markers of Trypanosoma cruzi variability: microsatellite instability and sequences wich code to antigenic proteins. It was not possible to observe mutations on the used markers, under the treatment conditions, in contrast to the results obtained with the gfp transfected strains. === O Trypanosoma cruzi é o protozoário agente causador da Doença de Chagas, doença que atinge cerca de 18 milhões de pessoas (WHO, 2002). Estudos biológicos, bioquímicos e moleculares indicam a existência de uma grande variabilidade genética entre as cepas deste parasita (Macedo et al, 2004). A estrutura populacional desta espécie, predominantemente clonal, com eventos raros ou ausentes de reprodução sexual (Ayala, 1993) contrasta com a alta variabilidade intra-específica e nos leva a questionar sobre o surgimento de tamanha diversidade. Acredita-se que o sistema de reparo de DNA em T. cruzi esteja envolvido nessa geração de variabilidade, já que o papel do reparo de erros de pareamento (MMR) em reduzir a taxa de mutação nos organismos já é bem conhecido (Hsieh, 2001). Foram observadas diferenças na eficiência do MMR sob condições de estresse entre diferentes linhagens de T. cruzi (Augusto-Pinto et al, 2003) o que nos levou a questionar se esta diferença seria refletida na taxa de mutação destas linhagens. Neste trabalho, realizamos estudos sobre mutações em diferentes cepas deste parasita, através da avaliação do efeito do cádmio sobre a instabilidade genética em T. cruzi e a investigação sobre possíveis diferenças na taxa de mutação entre as cepas. Desenvolvemos uma metodologia através da qual será possível determinar diretamente a taxa de mutação neste parasita, através de análise em FACS da fluorescência emitida por linhagens transfectadas com o gene gfp contendo uma mutação inserida em sua seqüência (gfp). Utilizando as linhagens transfectadas, os resultados indicam que o cádmio, na presença de água oxigenada, induz um aumento na taxa de mutação das cepas CL Brener e Colombiana. Verificamos ainda o efeito do cádmio como inibidor da atividade ATPásica da proteína recombinante TcMSH2. Por fim, foi investigada a estabilidade genômica das cepas JG, CL Brener e Colombiana expostas a cádmio e peróxido de hidrogênio por vários dias através da análise de marcadores clássicos de variabilidade em T. cruzi: microssatélites e seqüências que codificam proteínas antigênicas. Em contraste com os resultados obtidos com as linhagens expressando o gene de gfp mutado, nas condições utilizadas no tratamento concentrações dos agentes mutagênicos e período de exposição não foi possível observar a geração de mutações nos marcadores utilizados.