Avaliação neuroquímica do sistema colinérgico de camundongos com o gene do transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) modificado geneticamente

• Main Author: Cristina Martins e Silva
• Other Authors: Vania Ferreira Prado
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Minas Gerais 2008
• Online Access: http://hdl.handle.net/1843/SMOC-7JAPKY

=== The vesicular acetylcholine transporter (VACht) is responsible for acetylcholine (Ach) storage in synaptic vesicles, an important step for cholinergic transmission. Our goal was to study the role of VAChT in cholinergic tonus maintenance through the generation of mice presenting alterations in VAChT gene by homologous recombination.. One of used strategies was the insertion of a neomycin resistance cassette in untranslated 5 region of VAChT gene. This genetic modification generated mice HET HOM presenting reduced expression of VAChT (VAChT Knockdown). KD and KD present a 45% and 65% decrease in VAChT protein expression, respectively. Accumulation of not released Ach in brain of KD was observed and it is not related with increased expression or activity of ChAT (choline acetyltransferase) or CHT1 (High affinity choline transporter). Electrophysiological analysis at neuromuscular HET HOM and KD junction showed a decrease in quantal size distribution for both, KD specially in the second one. We produced mice in which VAChT gene was flanqued by LoxP sites to Flox/Flox generate VAChT mice. These mice were bred with mice expressing Cre enzyme in different regions of brain. The lineage generated would present deletion of VAChT Flox/Flox mice showed that gene in specific tissues. Our initial characterization of VAChT they presented decrease of 50% in VAChT mRNA expression, an increase of 100% in ChAT mRNA expression and an increase around 6 fold in brain Ach when compared to WT/WT VAChT animals. The amplitude, but not frequency, of miniature potentials Flox/Flox (MEEPs) in neuromuscular junction is increased in VAChT mice. However, Flox/Flox VAChT mice are phenotipically normals. Flox/WT Flox/Flox VAChT or VAChT animals were bred with mice expressing Cre Flox/Flox,cre+ under CAMKII promoter control. The generated VAChT are morphologicaly normals in birth, however, after five days of live they look smaller and Flox/Flox,cre+ not as active as the control littermates animals . Besides this, the VAChT mice present general muscular weakness, anormal development of spinal cord represented by a kyphosis and survive just 8 weeks. Another mice lineage was generated due to VAChT allele deletion: Flox/Del, cre+ Flox/Flox, cre+ VAChT . These mice present similar phenotype to VAChT mice; however this genotype present a reducted time life to approximately 20 days. Flox/Flox,cre- Flox/Del,cre- Even not shown Cre, VAChT and VAChT animals surprisely, present abolishment of VAChT in different regions of CNS. Besides this, ACh tissue Flox/Del, cre- WT/WT is 12 fold higher than in VAChT animals. content in VAChT Interestingly, comportamental and eletrophisiological studies, do not suggest alteration of VAChT, since the Cre- animals are phenotypically normals. Similarly to Flox/Del, cre+ Flox/Flox,cre- Flox/Del, cre- VAChT animals, VAChT and VAChT mice present VAChT mRNA, suggesting an unknown regulatory mechanism of VAChT expression. Our results confirm the important role of VAChT in cholinergic transmission through Ach releasing regulation and, in consequence, in maintaining normal physiological function of central and peripheral nervous system. === O transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) é responsável por armazenar acetilcolina em vesículas sinápticas, passo importante para a manutenção da transmissão colinérgica. Com o objetivo de estudar o papel do VAChT na manutenção do tônus colinérgico, geramos diferentes linhagens de animais em que esse gene foi alterado através de recombinação homóloga. Uma estratégia para interferir com a expressão do gene do VAChT foi a inserção de um cassete contendo o gene de resistência a neomicina na região 5 não traduzida do VAChT. Esta modificação genética gerou camundongos com diminuição HET HOM e KD da expressão do VAChT (VAChT Knockdown). Os animais KD apresentam redução de aproximadamente 45 e 65% da expressão de VAChT, respectivamente. Observamos acúmulo de acetilcolina não liberada no cérebro dos camundongos KD e isso não parece ser devido a alterações de expressão da choline acetyltransferase ou do transportador de alta afinidade de colina. Ensaios de eletrofisiologia na junção neuromuscular mostraram que existe uma diminuição no HET HOM tamanho do quanta nos camundongos KD e KD sendo a diminuição maior nos HOM HET camundongos KD que nos KD . Nós também produzimos camundongos em que o gene do VAChT foi Flox/Flox flanqueado por seqüências LoxP (camundongos VAChT ) a fim de utilizá-los para o acasalamento com camundongos que expressam a enzima Cre em diferentes regiões do cérebro. Os camundongos gerados, portanto, poderiam apresentar deleção do gene do VAChT em tecidos espeficos. Nossa caracterização inicial dos camundongos Flox/Flox VAChT mostrou que eles apresentam redução em torno de 50% na expressão do mRNA de VAChT, além de um aumento em torno de 100% na expressão do mRNA da enzima ChAT e um aumento de 6 vezes nos níveis de acetilcolina no cérebro quando WT/WT comparados com os animais VAChT . A amplitude dos potencias miniatura Flox/Flox (MEEPs) de placa motora está aumentada nos camundongos VAChT , sem Flox/Flox alterações na freqüência. Apesar dessas alterações, os camundongos VAChT são fenotipicamente normais. Flox/WT Flox/Flox Camundongos VAChT ou VAChT foram acasalados com camundongos que expressam Cre sob o controle do promotor CAMKII. Os Flox/Flox, cre+ camundongos VAChT gerados são morfologicamente normais ao nascimento, entretanto, após cinco dias de vida tornam-se menos ativos e exibem menor crescimento que os animais controle da mesma ninhada. Além disso, os camundongos Flox/Flox VAChT apresentam fraqueza muscular generalizada, desenvolvimento anormal da coluna espinhal acarretando em cifose e sobrevivem apenas cerca de 8 semanas. Nós também geramos uma linhagem de camundongos com a deleção de um dos alelos do Flox/Del, cre+ VAChT. Os camundongos VAChT , apresentaram os mesmos fenótipos dos Flox/Flox, cre+, Flox/Del, cre+ camundongos VAChT porem os camundongos VAChT sobrevivem apenas cerca de 20 dias. Flox/Flox,cre- Flox/Del, cre- Surpreendentemente, os animais VAChT e VAChT embora não expressem a Cre, apresentam ausência de VAChT em diversas regiões do SNC. Além disso, os níveis teciduais de acetilcolina também estão aumentados em torno de Flox/Del, cre-. doze vezes nos camundongos VAChT Interessantemente, nenhum dos estudos comportamentais e eletrofisiológicos realizados sugerem que o VAChT esteja alterado , já que os animais são fenotipicamente normais. Como os camundongos Flox/Flox,cre- Flox/Del, cre- VAChT e VAChT apresentam mRNA para o VAChT, é possível que exista um mecanismo regulatório da expressão do transportador ainda desconhecido. xiv Nossos resultados confirmam a importância de VAChT na regulação da liberação de acetilcolina e, consequentemente, na manutenção das funções fisiológicas normais do sistema nervoso central e periférico.