| Summary: | === The vesicular acetylcholine transporter (VACht) is responsible for acetylcholine
(Ach) storage in synaptic vesicles, an important step for cholinergic transmission. Our
goal was to study the role of VAChT in cholinergic tonus maintenance through the
generation of mice presenting alterations in VAChT gene by homologous
recombination..
One of used strategies was the insertion of a neomycin resistance cassette in
untranslated 5 region of VAChT gene. This genetic modification generated mice
HET HOM
presenting reduced expression of VAChT (VAChT Knockdown). KD and KD
present a 45% and 65% decrease in VAChT protein expression, respectively.
Accumulation of not released Ach in brain of KD was observed and it is not related
with increased expression or activity of ChAT (choline acetyltransferase) or CHT1
(High affinity choline transporter). Electrophysiological analysis at neuromuscular
HET HOM
and KD
junction showed a decrease in quantal size distribution for both, KD
specially in the second one.
We produced mice in which VAChT gene was flanqued by LoxP sites to
Flox/Flox
generate VAChT
mice. These mice were bred with mice expressing Cre enzyme
in different regions of brain. The lineage generated would present deletion of VAChT
Flox/Flox
mice showed that
gene in specific tissues. Our initial characterization of VAChT
they presented decrease of 50% in VAChT mRNA expression, an increase of 100% in
ChAT mRNA expression and an increase around 6 fold in brain Ach when compared to
WT/WT
VAChT animals. The amplitude, but not frequency, of miniature potentials
Flox/Flox
(MEEPs) in neuromuscular junction is increased in VAChT
mice. However,
Flox/Flox
VAChT mice are phenotipically normals.
Flox/WT Flox/Flox
VAChT or VAChT animals were bred with mice expressing Cre
Flox/Flox,cre+
under CAMKII promoter control. The generated VAChT are
morphologicaly normals in birth, however, after five days of live they look smaller and
Flox/Flox,cre+
not as active as the control littermates animals . Besides this, the VAChT
mice present general muscular weakness, anormal development of spinal cord
represented by a kyphosis and survive just 8 weeks.
Another mice lineage was generated due to VAChT allele deletion:
Flox/Del, cre+ Flox/Flox, cre+
VAChT . These mice present similar phenotype to VAChT mice;
however this genotype present a reducted time life to approximately 20 days.
Flox/Flox,cre- Flox/Del,cre-
Even not shown Cre, VAChT and VAChT animals surprisely,
present abolishment of VAChT in different regions of CNS. Besides this, ACh tissue
Flox/Del, cre- WT/WT
is 12 fold higher than in VAChT animals.
content in VAChT
Interestingly, comportamental and eletrophisiological studies, do not suggest alteration
of VAChT, since the Cre- animals are phenotypically normals. Similarly to
Flox/Del, cre+ Flox/Flox,cre- Flox/Del, cre-
VAChT
animals, VAChT and VAChT mice present
VAChT mRNA, suggesting an unknown regulatory mechanism of VAChT expression.
Our results confirm the important role of VAChT in cholinergic transmission
through Ach releasing regulation and, in consequence, in maintaining normal
physiological function of central and peripheral nervous system. === O transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) é responsável por
armazenar acetilcolina em vesículas sinápticas, passo importante para a manutenção da
transmissão colinérgica. Com o objetivo de estudar o papel do VAChT na manutenção
do tônus colinérgico, geramos diferentes linhagens de animais em que esse gene foi
alterado através de recombinação homóloga.
Uma estratégia para interferir com a expressão do gene do VAChT foi a
inserção de um cassete contendo o gene de resistência a neomicina na região 5 não
traduzida do VAChT. Esta modificação genética gerou camundongos com diminuição
HET HOM
e KD
da expressão do VAChT (VAChT Knockdown). Os animais KD
apresentam redução de aproximadamente 45 e 65% da expressão de VAChT,
respectivamente. Observamos acúmulo de acetilcolina não liberada no cérebro dos
camundongos KD e isso não parece ser devido a alterações de expressão da choline
acetyltransferase ou do transportador de alta afinidade de colina. Ensaios de
eletrofisiologia na junção neuromuscular mostraram que existe uma diminuição no
HET HOM
tamanho do quanta nos camundongos KD e KD sendo a diminuição maior nos
HOM HET
camundongos KD
que nos KD .
Nós também produzimos camundongos em que o gene do VAChT foi
Flox/Flox
flanqueado por seqüências LoxP (camundongos VAChT ) a fim de utilizá-los para
o acasalamento com camundongos que expressam a enzima Cre em diferentes regiões
do cérebro. Os camundongos gerados, portanto, poderiam apresentar deleção do gene do
VAChT em tecidos espeficos. Nossa caracterização inicial dos camundongos
Flox/Flox
VAChT mostrou que eles apresentam redução em torno de 50% na expressão do
mRNA de VAChT, além de um aumento em torno de 100% na expressão do mRNA da
enzima ChAT e um aumento de 6 vezes nos níveis de acetilcolina no cérebro quando
WT/WT
comparados com os animais VAChT . A amplitude dos potencias miniatura
Flox/Flox
(MEEPs) de placa motora está aumentada nos camundongos VAChT , sem
Flox/Flox
alterações na freqüência. Apesar dessas alterações, os camundongos VAChT
são
fenotipicamente normais.
Flox/WT Flox/Flox
Camundongos VAChT ou VAChT foram acasalados com
camundongos que expressam Cre sob o controle do promotor CAMKII. Os
Flox/Flox, cre+
camundongos VAChT gerados são morfologicamente normais ao nascimento,
entretanto, após cinco dias de vida tornam-se menos ativos e exibem menor crescimento
que os animais controle da mesma ninhada. Além disso, os camundongos
Flox/Flox
VAChT apresentam fraqueza muscular generalizada, desenvolvimento anormal
da coluna espinhal acarretando em cifose e sobrevivem apenas cerca de 8 semanas. Nós
também geramos uma linhagem de camundongos com a deleção de um dos alelos do
Flox/Del, cre+
VAChT. Os camundongos VAChT
, apresentaram os mesmos fenótipos dos
Flox/Flox, cre+, Flox/Del, cre+
camundongos VAChT porem os camundongos VAChT sobrevivem
apenas cerca de 20 dias.
Flox/Flox,cre- Flox/Del, cre-
Surpreendentemente, os animais VAChT e VAChT embora
não expressem a Cre, apresentam ausência de VAChT em diversas regiões do SNC.
Além disso, os níveis teciduais de acetilcolina também estão aumentados em torno de
Flox/Del, cre-.
doze vezes nos camundongos VAChT
Interessantemente, nenhum dos estudos
comportamentais e eletrofisiológicos realizados sugerem que o VAChT esteja alterado ,
já que os animais são fenotipicamente normais. Como os camundongos
Flox/Flox,cre- Flox/Del, cre-
VAChT
e VAChT apresentam mRNA para o VAChT, é possível que
exista um mecanismo regulatório da expressão do transportador ainda desconhecido.
xiv
Nossos resultados confirmam a importância de VAChT na regulação da
liberação de acetilcolina e, consequentemente, na manutenção das funções fisiológicas
normais do sistema nervoso central e periférico.
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