| Summary: | === Phylloseptins are antimicrobial peptides of 19 to 20 residues which are found in the skin secretions of the Phyllomedusa frogs that inhabit the tropical forests of South and Central Americas. The focus of this PhD thesis concerns structural and membrane-interactions studies of the peptides phylloseptin 1, 2 and 3 (PS-1, PS-2 and PS-3). These peptides carry an amidated C-terminus and they exhibit 74% sequence homology with major variations of only four residues close to the C-terminus. Here are investigated and compared the structures of the three phylloseptins in detail by circular dichroism (CD) and two-dimensional nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopies in the presence of phospholipid
vesicles or in membrane mimetic environments. Both CD and NMR spectroscopies reveal a high degree of helicity in the order PS-2 ? PS-1 > PS-3, where the main differences accumulate at the C-terminus. The conformational variations can be explained by taking into consideration electrostatic interactions of the negative ends of the helix dipoles with potentially cationic residues at positions 17 and 18. Whereas two are present in the sequence of PS-1 and -2, only one is present in PS-3. Furthermore, the additional role of hydrophobic interactions, hydrogen bonding, capping interactions and C-terminal amidation
for the stabilization of the helix and for antimicrobial action are discussed. Once amphipathic helical arrangements have been determined for the
three peptides by CD and solution NMR, these compounds (selectively labelled with 15N and 2H) were reconstituted into oriented phospholipid bilayers and solid-state NMR measurements were carried out. Although it is not possible to precisely determine the peptide orientation from 15N chemical shift or the 2H quadrupolar splitting alone, the two parameters furnished highly complementary topological restraints that have been used to obtain an accurate definition of the orientation of the peptides in the bilayers. Eventually, the 1H-15N dipolar splitting (obtained from PISEMA experiments) gave further topological restrains. PS-2
and PS-3 adopt perfect in-plane alignments, which is in plain agreement with their amphipathic structures lying at the membrane interface. Despite the high amphipathic character of PS-1, the polar C-terminal Asn-19 residue at the hydrophobic side of the helix forces a small deviation of the helix main axis with regards to an in-plane orientation. The structural and topological differences observed for the three phylloseptins in membrane-mimicking environments can be correlated to an advanced innate immunological system of the animal, as the storage of cocktails of antimicrobials in the skin makes available a larger choice
and, therefore, a defense mechanism that works against many different microorganisms. At the same time releasing mixtures of antimicrobial
compounds allows for a synergistic action of combinations of peptides. Another part of this work comprises structural studies and shielding
constant calculations by DFT (density functional theory) quantum methods. A strategy of peptide fragmentation aiming at a feasible molecular modelling of helical peptides has been proposed, and the obtained final structures have shown to be pretty similar to the ones obtained by solution NMR. A good agreement has been reached between experimental and theoretical chemical shifts and, therefore, the proposed strategy of molecular modelling proves to be a very promising tool in cases where problems like natural line-broadening or even other thermodynamic issues prevents the acquisition of good quality 2D NMR spectra. === As filoseptinas (phylloseptins) são peptídeos antimicrobianos de dezenove a vinte resíduos de aminoácidos encontrados na secreção da pele de anfíbios do gênero Phyllomedusa, que habitam as florestas tropicais das Américas do Sul e Central. O foco principal desta tese diz respeito a estudos estruturais e da interação das filoseptinas 1, 2 e 3 (PS-1, PS-2 e PS-3) com membranas. Esses peptídeos possuem a porção C-terminal naturalmente amidada e exibem 74% de homologia entre suas seqüências primárias, sendo que as principais variações envolvem apenas quatro resíduos próximos à fração C-terminal. Neste trabalho são investigadas e comparadas em detalhes as estruturas dessas três filoseptinas, sendo usadas para tal objetivo as espectroscopias de ressonância magnética nuclear (RMN) e de dicroísmo circular (CD) na presença de vesículas fosfolipídicas e/ou meios que mimetizam o ambiente de membranas. Ambas as espectroscopias indicaram um alto grau de ordenamento helicoidal para essas moléculas, o qual segue a ordem PS-2 PS-1 > PS-3. As variações conformacionais ocorrem principalmente nas porções C-terminais e elas são explicadas pela consideração de interações eletrostáticas do momento de dipolo negativo em C-terminal com os resíduos potencialmente catiônicos nas posições 17 e 18: enquanto o PS-1 e o PS-2 possuem dois resíduos capazes de suportar um carga positiva nessas posições, apenas um é observado para o PS-3. Além do mais, interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio, efeitos de capping de hélice, bem como a amidação C-terminal natural, desempenham importante papel na estabilização das estruturas peptídicas. Uma vez determinadas, por CD e RMN em solução, a existência de segmentos helicoidais anfipáticos bem definidos para os três peptídeos, esses compostos (seletivamente marcados com 15N e 2H) foram incorporados a bicamadas fosfolipídicas orientadas e então medidas de RMN em fase sólida foram efetuadas. Embora não tenha sido possível se determinarem com precisão as orientações dos peptídeos pelo uso exclusivo do deslocamento químico de 15N ou do desdobramento quadrupolar de 2H, os dois parâmetros forneceram restrições topológicas altamente complementares, as quais foram usadas para se obterem com precisão as orientações dos peptídeos nas bicamadas lipídicas. Eventualmente, o desdobramento dipolar de 1H-15N (obtido no espectro de PISEMA) forneceu restrições topológicas extras na determinação da orientação peptídica na bicamada. A PS-2 e a PS-3 adotam alinhamentos perfeitamente planares, o que está em pleno acordo com suas hélices anfipáticas dispostas na interface da membrana. A despeito do alto caráter anfipático da PS-1, o resíduo polar C-terminal de Asn-19, localizado na face hidrofóbica da hélice, força um pequeno desvio do eixo principal da hélice com relação à superfície da membrana. As diferenças estruturais e topológicas, observadas para as três filoseptinas em meios que mimetizam membranas, podem ser correlacionadas a um sistema imunológico inato de defesa avançado do animal, uma vez que o armazenamento de coquetéis de compostos antimicrobianos na pele torna disponível uma larga gama de escolha e, portanto, fornece um mecanismo que é ativo contra vários tipos de microorganismos. Não obstante, a liberação de misturas de agentes antimicrobianos permite a ação sinérgica de combinações de peptídeos. Uma outra parte deste trabalho, diz respeito a estudos estruturais e cálculos de constantes de blindagem por métodos DFT (teoria do funcional densidade) da química quântica. Nesses estudos foi proposta uma estratégia de "fragmentação peptídica", a qual tem por objetivo a definição de um método, que visa a modelagem de peptídeos -helicoidais. Tal estratégia mostrou ser bem eficiente, uma vez que as estruturas obtidas por métodos teóricos apresentaram uma alta similaridade com relação às estruturas obtidas por RMN em solução. Um bom acordo foi também obtido ao se compararem os valores de deslocamentos químicos teóricos e experimentais, o que indica que a estratégia de modelagem molecular proposta é bastante promissora e pode , portanto, ser empregada como uma importante ferramenta de análise em situações nas quais problemas como alargamento de linhas espectrais, ou mesmo outros fatores termodinâmicos, inviabilizam a aquisição de espectros bidimensionais de RMN com boa qualidade.
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