| Summary: | === Semen cryopreservation offers great advantages to equine reproduction programs by bringing genetic gain to them. Cryopreservation, however, reduces the quality of sperms due mainly to changes in sperm membranes similar to those which occur during sperm capacitation. Using seminal plasma proteins in the cryopreservation process may minimize deleterious effects on spermatozoa resulting from the action of cryopreservation process, making it valuable to improve the quality of equine spermatozoa both frozen and post-freezing. Thus, the purposes of this work were: identifying preventive procedures of deleterious effects from cryopreservation, investigating the effectiveness of molecular exclusion chromatography in the study of seminal plasma proteins in mammals, isolating and identifying the presence of serine protease inhibitors in equine seminal plasma, exploring comparatively natural and synthetic serine protease inhibitors as for their inhibiting activity in serine protease (bovine trypsin) enzymatic mechanism, introducing natural and synthetic inhibitors of serine protease in a diluting medium to freeze and thaw equine semen, assessing equine spermatozoa morphometric qualities with flow cytometry and comparing the effectiveness of trypan blue and propidium iodide when assessing equine spermatozoa physical integrity with flow cytometry. Three distinct experiments have been performed. The first of these experiments tested the technical application of molecular exclusion chromatography to identify seminal plasma proteins from three different animal species: equine, canine and caprine. According to evidence, molecular exclusion chromatography has been found to be an effective procedure to identify seminal plasma proteins. The second experiment has isolated, identified and evaluated serine protease inhibitor which is present in equine seminal plasma and its inhibiting potential. It has also explored comparatively natural and synthetic serine protease inhibitors as for their inhibiting activity, assessed the correlation between total protein concentration and serine protease inhibitor concentration of seminal plasma with sexual maturity in stallions. Active proteins have been identified to have a molecular mass of 6.3-7.0 kDa using mass spectrometry. Older stallions have shown a reduced total protein concentration of seminal plasma, but have maintained the concentration of serine protease inhibitors with a significant difference between means. Different serine protease inhibitor isoforms have been found in the semen of all stallions. The third experiment has verified the effect of adding serine protease inhibitors to the freezing and thaw medium of equine semen. There was no significant difference between control and treated groups as for the percentage of spermatozoa with progressive motility, functional plasma membrane, plasma membrane integrity, and intact acrosome and DNA fragmentation. No significant difference has been observed between control and treated groups, after inducing acrosome reaction with ionophore calcium A23187, suggesting that serine protease inhibitors do not block acrosome capacitation and reaction. It enabled comparing the effectiveness of two cromophores, Trypan blue and propidium iodide when assessing equine spermatozoa physical integrity by means of flow cytometry. The use of a staining with a lower value than Trypan blue has become very valuable in studies assessing equine spermatozoa, producing a cost reduction in the flow cytometry technique. The chromatography technique of molecular exclusion has presented important points to purify mammals seminal plasma proteins; making it possible to isolate and identify the presence of serine protease inhibitors in equine seminal plasma, in addition to noting that they present isoforms. The potential to naturally inhibit serine proteases is similar to that of synthetic inhibitors. Nevertheless, mo significant difference has been observed between control and experimental groups as for the action of inhibitors on improving the quality of cryopreserved equine spermatozoa. Further studies on isoform generation, peptide interactive mechanisms with sperm cells, determining N-terminal and adding larger doses of serine protease inhibitor in media containing different cryoprotectants are recommended === A criopreservação de sêmen oferece grandes vantagens para os programas de reprodução eqüina, promovendo ganho genético. No entanto, a criopreservação reduz a qualidade espermática devido principalmente a alterações das membranas espermáticas semelhante às que ocorrem durante a capacitação espermática. A utilização de proteínas do plasma seminal no processo de criopreservação poderia minimizar os efeitos deletérios sobre o espermatozóide.
Principalmente, dos efeitos resultantes da ação do processo de criopreservação tornando-se de grande valia para o melhoramento da qualidade do espermatozóide eqüino resfriado e póscongelamento. Deste modo, os objetivos deste trabalho foram: Identificar procedimentos preventivos para os efeitos deletérios da criopreservação, investigar a eficácia da técnica de cromatografia de exclusão molecular no estudo de proteínas do plasma seminal de mamíferos, isolar e identificar a presença de inibidores de serino proteases no plasma seminal eqüino, explorar comparativamente os inibidores naturais e sintéticos de serino protease quanto á sua atividade inibitória no mecanismo enzimático da serino protease (tripsina-bovina), introduzir inibidores naturais e sintéticos de serino proteases no meio diluidor de congelamento e resfriamento do sêmen eqüino, avaliar as qualidades morfométricas do espermatozóide eqüino através da citrometria de fluxo e comparar a eficiência do Azul de Tripan e do Iodeto de Propídio na avaliação da integridade física do espermatozóide eqüino através da citrometria de fluxo. Foram realizados três experimentos distintos. O primeiro destes experimentos testou a aplicação da técnica de cromatografia de exclusão molecular na identificação das proteínas do plasma seminal de três diferentes espécies animais: eqüina canina; caprina. Encontraram-se evidências de a cromatografia de exclusão molecular seja um procedimento satisfatório para identificação das proteínas do plasma seminal. O segundo experimento isolou, identificou e avaliou o inibidor de serino protease presente no plasma seminal eqüino e seu potencial de inibição. Também explorou comparativamente os inibidores naturais e sintéticos de serino protease quanto á sua atividade inibitória, avaliou a correlação entre concentração total de proteína e de inibidor de serino protease do plasma seminal com a maturidade sexual dos garanhões. Foram identificadas proteínas ativas com uma massa de molecular de 6.3-7.0 kDa usando espectrometria de massa. Os garanhões mais velhos mostraram uma redução na concentração total de proteína do plasma seminal, mas mantiveram a concentração dos inibidores de serino proteinase com diferença não significativa entre as médias. Também foram encontrados diferentes isoformas do inibidor de serino proteinase no sêmen de todos os garanhões. O terceiro experimento verificou o efeito da adição dos inibidores de serino protease ao meio de resfriamento e de congelamento do sêmen eqüino. Não houve diferença significativa entre o controle e os grupos tratados quanto à porcentagem de espermatozóide com motilidade progressiva, membrana plasmática funcional, integridade de membrana plasmática, acrossoma intacto e fragmentação de DNA. Não foi observada diferença significativa entre o grupo controle e os grupos tratados, depois da indução da reação de acrossômica com Cálcio Ionóforo A23187, sugerindo que os inibidores de serino protease não bloquearam a capacitação e reação acrossômica. Foi possível comprovar a eficácia dos dois cromóforos Azul de Tripan e Iodeto de Propídio na avaliação da integridade física do espermatozóide eqüino por meio de citometria de fluxo. A utilização de um corante com um valor mais baixo como o Azul de Tripan torna-se de grande valia aos estudos da avaliação do espermatozóide eqüino, proporcionando uma redução do custo da técnica na citometria de fluxo. A técnica de cromatografia de exclusão molecular apresentou pontos importantes para purificação de proteínas do plasma seminal de mamíferos; foi possível isolar e identificar a presença de inibidores de serino proteases no plasma seminal eqüino, além de se observar que esses apresentam isoforma; o potencial de inibição dos inibidores naturais de serino proteases é similar ao dos inibidores sintéticos. Contudo, não foram encontradas diferenças significativas entre o controle e os grupos experimentais quanto à ação dos inibidores na melhoria da qualidade do espermatozóide eqüino criopreservado. Recomendam-se novos estudos sobre a formação das isoformas, os mecanismos de interação do peptídeo com as células espermáticas, determinação do N-terminal e a adição de doses maiores do inibidor de serino protease em meios contendo diferentes crioprotetores
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