Instabilidade de microssatélites em carcinoma colorretal de pacientes jovens por técnicas de biologia molecular em amostras processadas rotineiramente para diagnóstico anátomo-patológico

• Main Author: Ernanda Raquel de Queiros G. de S. e Fernandes
• Other Authors: Ana Margarida Miguel Ferreira Nogueira
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Minas Gerais 2007
• Online Access: http://hdl.handle.net/1843/ECJS-78HGHK

=== Introduction: Colorectal cancer (CCR) is the second most common neoplasia in the developing countries, after lung cancer in men and breast cancer in women. Microsatellites are repetitive short sequences of nucleotides in all human being genome, susceptible to enlarged or contract itself during DNA replication. Tumors that present deficiency in DNA repair genes (MMR), these expansions or contractions are not repaired, causing microsatellites instability (MSI), that can be high (MSI-H) or low (MSI-L). Microsatellites are considered phenotype markers for prognostic, therapeutic reply and identification of patients with mutations in MMR. Patients with mutations in MMR are supposed to develop hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) syndrome. MSI was present in the majority of the CCR patients with HNPCC (5%) and about 15% in sporadic tumors. Therefore, MSI evaluation in CCR shows practical importance and in near future its research may be suggested as a complement for diagnosis and prognostic in these tumors. Objectives: To standardize molecular biology method for the detection of MSI in CCR samples from young patients performed routinely for anatomic-pathologic diagnosis, to characterize MSI as high or low, to correlate presence and type of MSI with the anatomic-pathologic characteristics of CCR. Material and methods: A total of 48 patients, 40 years old or less, presenting CCR was studied. Selected cases were gotten from material embedded in paraffin. Most adequate tumor areas and normal mucosa from the same patient were selected through optic microscopy in order to perform molecular tests by polymerase chain reaction (PCR). The extractions were carried out using commercial kit. Electrophoreses were performed in polyacrilamide gel. Microsatellites: BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 and D17S250[Mfd15CA ] were tested. Results: Adequate DNA for MSI research was extracted in almost all cases, except for one case in which only one microsatellite amplified (BAT26). Microsatellite BAT26 presented higher amplification frequency (100%) and D2S123 presented lower amplification frequency (83.3%), from the total, 21 cases (43.8%) presented stable microsatellites (MSE), 24 cases (50%) presented MSI, 15 cases (62.5%) with MSI-H and 7 cases (29.2%) MSI-L. The majority of CCR (60.5%) was located in left colon and was predominantly annularconstrictive (39.6%). Lymphocytic reply was discrete or absent in the majority of the cases (58.1%). The majority of the tumors was considered as pT3 (67.4%) and 14 cases (38.9%) showed metastasis in lymphonodes. Tumors with instability were more frequent in men and were located preferentially in right colon and lymphocytic reply was the most frequent found. Conclusions: The result of the detention of DNA allelic amplification varied according to the tested microsatellites. The most sensible microsatellite was BAT26 (100%) and the least sensible was D2S123 (83.3%). The frequency of MSE cases was lower than MSI cases. Among unstable cases, the frequency of MSI-H cases was higher than MSI-L cases. In MSI-L cases the instability in the mononucleotides microsatellites was not found (BAT25 and BAT26). CCR with MSI was more frequent in men and was located preferentially in right colon, with annular-constrictive macroscopy, peritumoral lymphocytic reply from discrete to moderate. === Introdução: O câncer colorretal (CCR) é a segunda neoplasia mais comum nos países em desenvolvimento depois do câncer de pulmão em homens e do câncer de mama em mulheres. Os microssatélites são seqüências curtas repetitivas de nucleotídeos presentes em todo genoma humano, susceptíveis a expandir-se ou contrair-se durante a replicação do DNA. Nos tumores com deficiência nos genes de reparo do DNA (MMR), essas expansões ou contrações não são reparadas, ocasionando o fenômeno de instabilidade de microssatélites (IMS), que pode ser alta (IMS-A) ou baixa (IMS-B). Os microssatélites são considerados marcadores fenotípicos de prognóstico, de resposta terapêutica e de identificação de pacientes com mutações nos MMR. Pacientes com mutações nos MMR estão predispostos a desenvolver a síndrome do câncer colorretal não-poliposo hereditário (HNPCC). A IMS foi descrita na maioria dos CCR de pacientes com HNPCC (5%) e em cerca de 15% dos tumores esporádicos. Assim, a avaliação da IMS no CCR reveste-se de enorme importância prática e há a idéia de que, num futuro próximo, sua pesquisa seja sugerida como complemento do diagnóstico e prognóstico nestes tumores. Objetivos: Padronizar o método de biologia molecular para a detecção de IMS em amostras de CCR de pacientes jovens processadas rotineiramente para diagnóstico anátomo-patológico, caracterizar a IMS em alta ou baixa, correlacionar a presença e o tipo de IMS com as características anátomo-patológicas do CCR. Material e métodos: Foram estudados 48 CCR de pacientes com idade igual ou inferior a 40 anos. Os casos selecionados foram provenientes de material emblocado em parafina. Selecionaram-se à microscopia óptica, as áreas mais adequadas do tumor e da mucosa normal, de um mesmo paciente, para a realização dos testes moleculares, feitos através da reação em cadeia da polimerase (PCR). As extrações foram feitas utilizando-se kit comercial. As eletroforeses foram feitas em gel de poliacrilamida. Os microssatélites testados foram BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 e D17S250[Mfd15CA]. Resultados: Extraiu-se DNA adequado para a pesquisa de IMS em todos os casos, à exceção de um caso, pois apenas um microssatélite amplificou (BAT26). O microssatélite com maior freqüência de amplificações foi o BAT26 (100%) e o menos freqüente foi o D2S123 (83,3%); 21 casos (43,8%) apresentaram-se microssatélites estáveis (MSE), 24 casos (50%) apresentaram-se com IMS, 15 casos (62,5%) com IMS-A e sete casos (29,2%) com IMS-B. A maioria dos CCR (60,5%) localizava-se no cólon esquerdo, eram predominantemente anulares-constritivos (39,6%). A resposta linfocítica era discreta ou ausente na maior parte dos casos (58,1%). A maioria dos tumores foi estadiada como pT3 (67,4%) e 14 casos (38,9%) tinham metástases em linfonodos. Os tumores com instabilidade eram mais freqüentes em homens, localizavam-se preferencialmente no cólon direito e a resposta linfocítica era mais freqüentemente encontrada. Conclusões: O resultado da detecção da amplificação alélica do DNA variou conforme o microssatélite testado. O microssatélite mais sensível foi o BAT26 (100%) e o menos sensível foi o D2S123 (83,3%). A freqüência de casos MSE foi menor que a de casos com IMS. Entre os casos instáveis, a freqüência de casos com IMS-A foi maior que a de casos com IMS-B. Nos casos com IMS-B não foi encontrada instabilidade nos microssatélites mononucleotídeos (BAT25 e BAT26). Os CCR com IMS foram mais freqüentes em homens, localizavam-se preferencialmente no cólon direito, com macroscopia anular-constritiva, com resposta linfocítica peritumoral de discreta a moderada.