Efeito de um inibidor dual da enzima fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) e do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) nas alterações patológicas induzidas por peptídeo -amilóide 1-42 in vivo e in vitro

• Main Author: Paula Maria Quaglio Bellozi
• Other Authors: Antonio Carlos Pinheiro de Oliveira
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Minas Gerais 2014
• Online Access: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9MYKCQ

=== Introduction: Alzheimers Disease (AD) is a neurodegenerative disease, which is the main cause of dementia. Its main symptom is the cognitive deficit, specially memory loss and learning disability, and the current therapy do not stop disease progression. There is neuronal death, neuroinflammation and changes in neurotrophins production in AD. The PI3K/ Akt/ mTOR pathway is involved in cellular metabolism, growth and survival, and it seems to be overactivated in AD. Therefore, the aim of the present study is to investigate the effects of the treatment with a dual PI3K and mTOR inhibitor, NVP-BEZ235, in a murine model of AD and hippocampal neuronal cultures stimulated with amyloid-. . Methods: Male C57Bl/6 mice were submitted to perform stereotactic surgery to intra-hippocampal injection of 400 pmol of amyloid-â 1-42 in a volume of 0.5 ml or PBS. Animals were treated 8 days with NVP-BEZ235 25 mg/Kg, rivastigmine 0,3 mg/Kg or their vehicles, and then submitted to object recognition task. Following that, animals were submitted to intracardiac perfusion in order to obtain hippocampal cerebral slices, or their cerebral tissues were removed. The slices were stained with NISSL, to access cellular viability, or Fluoro-JadeÒ C to access neuronal death. The hippocampus were processed in order to measure neurotrophic factors BDNF and NGF levels, as well as inflammatory mediators IL-1â IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-, IFN- and IL-17A levels. In in vitro experiments, hippocampal neuronal cultures were prepared from newborn C57Bl/6 mice. Amyloid- â or its vehicle were added to the cultures and the treatment was done with memantine or NVP-BEZ235 20 or 100 M, to access the neuronal death assay. Statistical analysis were performed using GraphPad Prism 5 and expressed as mean ± SEM (P<0,05). Results: Mice that received amyloid-â revealed memory loss, significantly reversed with NVP-BEZ235. There was a tendency of neuronal death increase in CA1, dentate gyrus and CA3 of hippocampus in animals receiving amyloid-â, which was reversed with the PI3K and mTOR inhibitor. In cultures, there was a neuronal death following treatment with amyloid-â, which was also significantly prevented with memantine and NVP-BEZ235. No difference was observed in the levels of BDNF, NGF, IL-1â, IL-2, IL-4, IFN-ã and IL-17A in both ipsilateral and contralateral hippocampus. However, there was an increase in IL-6 (p=0,079) and TNF-á (p=0,056) levels in ipsilateral hippocampus of mice treated with NVP-BEZ235, as well a significant increase in IL-10. Conclusions: Amyloid-â induces cognitive changes and neuronal death in vitro, which can be reversed or prevented by NVPBEZ235 treatment. Furthermore, the drug seems to improve neuronal survival and change pro- and anti-inflammatory cytokines levels. Thus, the mechanism by which the drug improves cognitive parameters might be related to neuronal death decrease and changes in the production of cytokines involved in memory. === Introdução: A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa, sendo a principal forma de demência. O principal sintoma é déficit cognitivo, especialmente a perda de memória e dificuldade de aprendizado, e os fármacos utilizados atualmente no tratamento não retardam a progressão da doença. Na DA, observa-se morte neuronal, neuroinflamação e alteração da produção de fatores neurotróficos. A via PI3K/ Akt/ mTOR é importante para a regulação do metabolismo, crescimento e sobrevivência celular, e estudos indicam que uma hiperativação da via pode ser observada na DA. Dessa forma, este estudo investiga os efeitos do tratamento com um inibidor dual de PI3K e mTOR, o NVP-BEZ235 em modelo murino de DA e em cultura de neurônios hipocampais estimulados com peptídeo b-amiloide. Metodologia: Os experimentos in vivo foram realizados em camundongos C57Bl/6 machos, que foram submetidos a uma cirurgia estereotáxica para injeção intrahipocampal de 400 pmol de â-amilóide 1-42 em um volume de 0,5 mL ou PBS. Os animais foram tratados por 8 dias com NVP-BEZ235 25 mg/Kg, rivastigmina 0,3 mg/Kg ou seus respectivos veículos, e submetidos à tarefa de reconhecimento de objetos. Posteriormente, foi realizada perfusão intracardíaca para obtenção dos cortes cerebrais de hipocampo, ou a retirada do hipocampo a fresco. Os cortes de hipocampo foram marcados pela técnica de NISSL, para verificar a viabilidade celular, ou de Fluoro-JadeÒ C, para avaliar a morte neuronal. Os hipocampos retirados a fresco foram processados para determinação dos fatores neurotróficos, BDNF e NGF, bem como dos mediadores inflamatórios, IL-1â IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-, IFN- e IL-17A. Para os experimentos in vitro, foi preparada a cultura de neurônios hipocampais de camundongos C57Bl/6 recém-nascidos. Foi adicionado o peptídeo â-amilóide ou seu veículo, realizado o tratamento com memantina ou NVPBEZ235 20 ou 100 M, e o ensaio de morte celular. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa GraphPad Prism 5 e expressos em média ± EPM (P<0,05). Resultados: Os camundongos que receberam â-amilóide apresentaram comprometimento da memória, revertido significativamente pelo NVP-BEZ235. Houve uma tendência ao aumento de morte neuronal em CA1, giro denteado e CA3 do hipocampo dos animais tratados com â-amilóide, efeito revertido pelo inibidor de PI3K e mTOR. Nas culturas, o peptídeo também provocou morte neuronal, que foi prevenida significativamente por memantina e NVP-BEZ235. Não houve alterações na expressão de BDNF, NGF, IL-1â, IL-2, IL-4, IFN-ã e IL-17A, tanto no hipocampo ipsilateral quando no contralateral. Entretanto, no hipocampo ipsilateral dos animais tratados com NVP-BEZ235, há um aumento de IL-6 (p=0,079) e TNF-á (p=0,056), bem como um aumento significativo na expressão de IL-10. Conclusões: A â- amilóide induz alterações cognitivas e um aumento de morte neuronal in vitro, que podem ser revertidos ou prevenidos pelo tratamento com NVP-BEZ235. Além disso, in vivo, o fármaco parece melhorar a sobrevivência neuronal, e altera a expressão de citocinas pró- e anti-inflamatórias. Desta forma, o mecanismo pelo qual o NVPBEZ235 melhora o aspecto cognitivo dos animais pode estar relacionado à redução da morte neuronal, além da alteração na produção de citocinas que estão envolvidas em memória.