Regulação da expressão da proteína cinase PKR na ausência de interferons (IFNs) e seu papel na resposta celular mediada por agonistas dos receptores TLR2 e TLR4

• Main Author: Paula Cristiane Motta Sales
• Other Authors: Aristobolo Mendes da Silva
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Minas Gerais 2012
• Online Access: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9L7NEM

=== The role of protein kinase R (PKR) in the antiviral cell state induced by interferons (IFNs) is well known. The increase in its expression in response to stimulation by IFNs results in its autophosphorylation and phosphorylation of its substrate eIF2-alpha. This molecular event interferes with translation initiation of mRNA, which in turn results in inhibition of protein synthesis. Recent studies suggest the involvement of PKR in bacterial infections. However, how PKR is activated and what is its biological role in these infections is still largely unexplored. Thus, the central objective of our study was to examine the regulation of expression of PKR in the signaling pathway triggered by agonists of TLR2 and TLR4 in a human promonocytic, THP-1. THP-1 monocytes were treated with LPS (TLR4 agonist) or Pam3CSK4 (TLR2 agonist) in increasing doses or at different time intervals. At the end of these treatments, total RNA and protein extracts were obtained for analysis of the relative abundance of mRNA PKR by real time PCR and protein levels by western blot assays, respectively. The results showed a significant increase in the levels of mRNA PKR and PKR protein. Surprisingly, we did not observe any increase in the levels of transcripts of IFN-beta or subtypes of IFN-alpha. Moreover, treatment of THP-1 cells with LPS or Pam3CSK4 did not result in STAT1 phosphorylation. Supernatants taken from THP-1 cells treated with LPS or Pam3CSK4 did not caused the activation of PKR or ISG56 promoters in reporter gene assays carried out in HEK293T cells. These results provide evidence that in THP-1 monocytes exposed to stimulation with TLR4 and TLR2 agonists, neither transcriptional activation nor production of type I IFNs is observed, and therefore the PKR expression occurs in the absence of IFNs. Once the promoter region of PKR contains other regulatory elements as candidates for its expression regulation, including NF-IL6, NF-kB, Sp1 and Sp3, we decided to assess the effect of three pharmacological inhibitors. The pretreatment of the THP-1 cells with TPCK or Bay11 7082, pharmacological inhibitors of the transcription factor NF-B, inhibited the PKR expression induced by bacterial agonists. The same was observed when cells were pretreated with Mithramycin, an inhibitor of Sp1/Sp3 transcription factor. However, analysis of the phosphorylation of STAT1 in THP-1 cells differentiated to macrophages suggests the involvement of IFNs in cells treated with the TLR4 agonist, but not with TLR2. The monocytes are one of the major cells of the innate immune responses and are essential for host defense against a wide range of pathogens, having an important role in sepsis. We analyzed and compared the survival of WT and PKR-/-polymicrobial sepsis model. The results indicated that PKR appears to play a detrimental role to the host, as PKR-deficient mice survive from sepsis. Our results demonstrate that PKR expression in human monocytes stimulated with bacterial agonists TLRs occurs independently of IFNs, and that the regulatory mechanisms of its expression involve transcription factors that are critical in the inflammatory response. Furthermore, results obtained from the experiments in vivo demonstrate that PKR is an important target for studies of sepsis. Therefore, our study provides new insight into the mechanisms of transcriptional activation of PKR and its role on the innate immune response against bacterial pathogens. === O papel da proteína cinase dependente de RNA de dupla fita (PKR) no estado celular antiviral induzido por interferons (IFNs) é bastante conhecido. O aumento de sua expressão em resposta à estimulação por IFNs pode resultar em sua autofosforilação levando à fosforilação de seu substrato eIF2-alfa. Este evento molecular interfere no início da tradução do mRNA, que por sua vez resulta em inibição da síntese protéica. Estudos recentes sugerem o envolvimento de PKR em infecções bacterianas. No entanto, como PKR é ativada e qual é o seu papel biológico nessas infecções é ainda pouco explorado. Assim, o objetivo central do nosso trabalho foi examinar a regulação da expressão da proteína cinase PKR na via de sinalização disparada por agonistas dos receptores TLR2 e TLR4 em uma linhagem promonocítica humana THP-1. Monócitos THP-1 foram tratados com LPS (agonista de TLR4) ou Pam3CSK4 (agonista de TLR2) em doses crescentes ou em diferentes intervalos de tempo. Ao final desses tratamentos, o RNA total e extratos protéicos foram obtidos para análise da abundância relativa do mRNA de PKR por PCR em tempo real e de seus níveis protéicos por ensaios de western-blot, respectivamente. Os resultados mostram um aumento significativo dos níveis do mRNA e protéicos de PKR. De modo surpreendente, não foi observado qualquer aumento nos níveis dos transcritos de IFN-beta ou dos subtipos de IFN-alfa. Além disso, o tratamento das células THP-1 com LPS ou Pam3CSK4 não resultou na fosforilação de STAT1. Os sobrenadantes das células THP-1 tratadas com LPS ou Pam3CSK4 não acaretaram na ativação dos promotores de PKR ou ISG56 em ensaios de gene repórter conduzidos em células HEK293T. Esses resultados fornecem vidências que em monócitos THP-1 expostos à estimulação com agonistas TLR2 e TLR4 não ocorre a ativação transcricional nem tanto a produção de IFNs do tipo I, e que portanto, a expressão de PKR ocorre na ausência de IFNs. Uma vez que a região promotora de PKR contém outros elementos regulatórios candidatos para sua regulação como NF-IL6, NF-kB, Sp1 e Sp3, decidimos avaliar o efeito de três inibidores farmacológicos. O pré-tratamento das células THP-1 com TPCK ou com Bay11-7082, inibidores farmacológicos do fator de transcrição NF-B, inibiu a expressão de PKR induzida pelos agonistas bacterianos. O mesmo foi observado quando as células foram pré-tratadas com Mitramicina, um inibidor do fator de transcrição Sp1/Sp3. No entanto, análises da fosforilação de STAT1 em células THP-1 diferenciadas a macrófagos sugerem a participação de IFNs em células tratadas com o agonista de TLR4, mas não com TLR2. Os monócitos são uma das principais células da resposta imune inata sendo essenciais para defesa do hospedeiro contra uma gama de patógenos, tendo papel importante na septicemia. Assim, avaliamos e comparamos a sobrevivência de camundongos WT e PKR-/- em modelo de sepse polimicrobiana. Os resultados revelaram que PKR parece ter um papel prejudicial ao hospedeiro, uma vez que a deficiência de PKR impede que os camundongos sucumbam à sepse grave. Nossos resultados demonstram que a expressão de PKR em monócitos humanos estimulados com agonistas TLRs bacterianos ocorre de modo independente de IFNs, e que os mecanismos de regulação de sua expressão envolvem fatores de transcrição críticos da resposta inflamatória. Além disso, os resultados obtidos de experimentos in vivo demonstram que PKR é um importante alvo para estudos de septicemia. Portanto, nosso estudo fornece uma nova visão sobre os mecanismos de ativação transcricional de PKR e de seu papel sobre a resposta imune inata contra componentes bacterianos.