| Summary: | === Proteinase-activated receptors (PAR) are part of a family of G-protein-coupled receptors that are activated by serine proteases via proteolytic cleavage of a specific sequence of amino acids in N-terminal portion, and its activation has been associated with the regulation of different inflammatory phenomena. These receptors were classified from 1 to 4 by order of discovery, have structural similarities but also have differences in the group N-terminal and the serine-protease responsible for cleavage. PAR-2 is expressed in the airways, the epithelium, endothelium and smooth muscle tissue of the lung, trachea and bronchial fibroblasts and inflammatory cells such as mast cells and eosinophils. In recent years, studies have shown the involvement of PAR-2 in the recruitment and activation of leukocytes, however, although there are few studies in the literature showing the presence and activation of PAR-2 in eosinophils, the mechanisms involved in molecular signaling triggered by activation of this receptor by their respective agonists are not well understood. Our objective was to evaluate the role of PAR-2 in the control of eosinophil recruitment in experimental pleurisy, as well as the participation of mast cell tryptase and its importance in inhibiting this phenomenon. The experimental protocols were approved by the animal ethics committee (CEUA / UFMG, 193/2012). After the treatment protocol, mice were sacrificed in a CO2 chamber, and pleural lavage was collected for further analysis in the proper times. One-Way ANOVA followed by Newman-Keuls post-test was used for analysis of cell migration and Student's t test for analysis of western blotting. Intrapleural (i.pl.) injection in naive BALB/c mice with selective agonist of PAR-2 SLIGRL-NH2 (30 g), or mast cell tryptase (300 ng) or ovalbumin (OVA; 1 g) in animals previously sensitized to this antigen, induced eosinophil recruitment into the pleural cavity of these animals. Thus, mice were injected i.pl. with selective antagonist of PAR-2 ENMD1068 (3 g) 15 minutes before the i.pl. injection OVA (1g) in mice immunized; or with mast cell tryptase (300 ng) and eotaxin-1 (100 ng) in naive mice to study the role of the PAR-2 in the recruitment of eosinophils. The ENMD1068 inhibited eosinophilia induced by OVA (97%), by tryptase (87%), and also by eotaxin-1 (61%), suggesting the involvement of PAR-2 activation in the recruitment of eosinophils induced by these stimuli. Otherwise, in mice treated with tryptase (300 ng) we evaluated receptor expression 4, 8, 24 and 48 hours after stimulation i.pl., using western blotting. The results demonstrated increased receptor expression 24 and 48 hours after treatment compared to their respective controls in leukocytes obtained pleural lavage. Furthermore, immuno-histochemical tests have demonstrated co-localization of the receptor PAR-2 in the membrane and cytoplasm of eosinophils and mononuclear cells 24 and 48 hours after i.pl. challenge with tryptase. Once demonstrated the involvement of PAR-2 in eosinophil recruitment induced by tryptase we evaluated the importance of endogenous tryptase to the recruitment of eosinophils in the pleurisy model, and the pre-treatment with APC366 (5 mg/kg), a selective inhibitor of tryptase, decreased the recruitment of eosinophils induced by SLIGRL-NH2 (30 g) and eotaxin-1 (100 ng). In conclusion, our results suggest a role of PAR-2 activation in the control of eosinophils recruitment and thus in the development of the inflammatory response in the pleural cavity. The present study contributes to the understanding of the mechanisms involved in eosinophilia, suggesting the blockage of PAR-2 as a new therapeutic strategy for its control. Financial support: CNPq/CAPES/ FAPEMIG. === Os receptores ativados por proteases (proteinase-activated receptor, PAR) fazem parte de uma família de receptores acoplados à proteína G que são ativados por serino-proteases através da clivagem proteolítica de uma sequência específica de aminoácidos em sua porção N-terminal. Sua ativação vem sendo associada à regulação de diferentes fenômenos inflamatórios. Estes receptores foram classificados de 1 a 4 por ordem de descoberta apresentando similaridade estrutural mas, também possuem diferenças no grupamento N-terminal e da serino-protease responsável pela clivagem. PAR-2 é expresso nas vias aéreas, no epitélio, endotélio e músculo liso do tecido pulmonar, fibroblastos da traqueia e brônquios, e células inflamatórias tais como mastócitos e eosinófilos. Nos últimos anos, estudos têm demonstrado o envolvimento de PAR-2 no recrutamento e na ativação de leucócitos, no entanto, embora existam na literatura alguns estudos mostrando a presença e ativação de receptores PAR-2 em eosinófilos, ainda não estão bem esclarecidos os mecanismos moleculares envolvidos na sinalização desencadeada pela ativação deste receptor pelos seus respectivos agonistas. Nosso objetivo foi avaliar o papel do PAR-2 para o recrutamento de eosinófilos em pleurisia experimental, bem como a participação da triptase de mastócitos e a importância de sua inibição para este fenômeno. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética animal (CEUA/UFMG, 193/2012). Após realização do protocolo de tratamento os animais foram sacrificados em câmara de CO2, e o lavado pleural foi coletado para posteriores análises nos tempos adequados. As análises estatísticas utilizadas foram: One-Way ANOVA seguido do pós-teste de Newman-Keuls para as análises de migração celular e Students t test para as análises de western blotting. A injeção intrapleural (i.pl.) em camundongos BALB/c naive com agonista seletivo de PAR-2 SLIGRL-NH2 (30 g), ou triptase de mastócitos (300 ng) ou ovalbumina (1 g), em animais previamente sensibilizados para este antígeno, induziu recrutamento de eosinófilos para a cavidade pleural destes animais. Sendo assim, camundongos foram injetados por via i.pl. com antagonista seletivo de PAR-2 ENMD1068 (3 g) 15 minutos antes da injeção i.pl. de OVA (OVA; 1 g), em camundongos imunizados, ou com triptase de mastócitos (300 ng) ou eotaxina-1 (100 ng) em camundongos naive para estudar o papel de PAR-2 no recrutamento de eosinófilos. O ENMD1068 inibiu a eosinofilia induzida por OVA (97%), por triptase (87%) como também por eotaxina-1 (61%), o que sugere a participação da ativação de PAR-2 no recrutamento de eosinófilos induzido por estes estímulos. De outra forma, em camundongos tratados com triptase (300 ng) foi avaliada a expressão de PAR-2 por western blotting 4, 8, 24 e 48 horas após o estímulo i.pl. demonstrando aumento da expressão do receptor 24 e 48 horas após o tratamento quando comparados aos respectivos controles, em leucócitos obtidos do lavado pleural. Além disso, testes de imuno-citoquímica demonstraram co-localização do receptor PAR-2 na membrana e citoplasma de eosinófilos e células mononucleares 24 e 48 horas após desafio i.pl. com triptase. Uma vez demonstrada a participação do PAR-2 no recrutamento de eosinófilos induzido pela triptase, foi avaliada a importância da triptase endógena para o recrutamento de eosinófilos no modelo de pleurisia, e o pré-tratamento com APC366 (5 mg/kg) via um inibidor seletivo de triptase, diminuiu o recrutamento de eosinófilos induzido pelo SLIGRL-NH2 (30 g) ou eotaxina-1 (100ng). Em conclusão, nossos resultados sugerem um papel de PAR-2 e de sua ativação no controle do recrutamento de eosinófilos, e consequentemente para o desenvolvimento da resposta inflamatória na cavidade pleural. O presente estudo contribui para o entendimento dos mecanismos envolvidos na eosinofilia, sugerindo uma nova estratégia terapêutica para o seu controle, através do bloqueio de PAR-2. Suporte financeiro: CNPq/CAPES/ FAPEMIG.
|
|---|
