Estudo do gene da fotoliase de tripanossomatídeos: expressão heteróloga do gene de Trypanosoma brucei EM Trypanosoma cruzi

• Main Author: Egidio Paulo Francisco Nhavene
• Other Authors: Carlos Renato Machado
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Minas Gerais 2014
• Online Access: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9HYFYX

=== The Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei are the protozoa parasites that cause African and American trypanosomiasis. Both are characterized by the presence of a single flagellum, a kinetoplast, which is elongated and single mitochondria that occupies much of the cell volume concatenated into a network of DNA. These parasites also exhibit homogeneous morphological characteristics, defined according to the position of the kinetoplast in relation to the nucleus and the presence or absence of flagellum and undulating membrane. Inside of the invertebrates insect host they occur as metacyclic trypomastigotes and epimastigotes forms, while inside of the mammiferous vertebrates hosts may be found as amastigote and bloodstream trypomastigote forms. The genome sequencing of these parasites showed the existence of genes that is related to DNA maintenance such as direct reversal of base changes by dimethylation processes or by the action of photolyases and dioxygenases or by removal of incorrectly incorporated bases repairing by MMR, removal of bulky damage by NER and removal of damage bases by BER, repair of SSBs and repair of DSB by HR. Among the repair pathways described above, Photoreactivation is a direct repair mechanism that catalyzes the reversion of pyrimidine dimers in monomers. There are several kinds of photolyases according to their substrate specificity. Another mechanism to repair UV-induced lesions is NER, which can be divided into two major pathways: Global Genome Repair and the Transcription Coupled Repair. The T. brucei has two photolyase genes, a nuclear photolyase gene which encodes a single stranded photolyase or cryptochromes DASH and a mitochondrial photolyase gene which encodes a CPD photolyase class I. However, the T. cruzi has only the mitochondrial photolyase gene which encodes a single stranded photolyase or cryptochromes DASH. In the present work we studied the effect of UV radiation in wild-type cells, T. cruzi strains heterologously expressing the T. brucei nuclear photolyase gene, T. cruzi CSB single-knockout cells and CSB single-knockout T. cruzi strains heterologously expressing the T. brucei nuclear photolyase gene. The results show that T. cruzi heterologously photolyase the nuclear gene of T. brucei are more resistant to UV irradiation than the wild type. There was not the same activity in T. cruzi CSB single-knockout strains heterologously expressing the T. brucei nuclear photolyase gene. Another important fact is that the wild-type cells, when placed for 60 min under white light after treatment with UV light, do not return to growth. These data suggest that photolyase. === O Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei são protozoários parasitas causadores da Tripanossomíase Americana e Africana. Ambos são caracterizados pela presença de um flagelo simples e um cinetoplasto que é uma mitocôndria única e alongada que ocupa grande parte do volume celular, concatenados em uma rede de DNA. Apresentam também características morfológicas muito homogêneas, definidas em função da posição do cinetoplasto em relação ao núcleo e da presença ou não de flagelo livre e membrana ondulante. No interior dos hospedeiros invertebrados insetos ocorrem sob a forma tripomastigotas metacíclicos e epimastigotas; e nos hospedeiros vertebrados mamiferos ocorre sob a forma amastigota e tripomastigota sanguíneo. O sequenciamento do genoma desses parasitos revelou a existência de genes relacionados à manutenção do DNA tais como: a reversão direta das modificações de base por processos de dimetilação e por ação das fotoliases ou dioxigenases ou ainda por retirada de bases incorporadas erradamente no DNA recém-replicado pelo MMR, retirada de danos volumosos por NER e retirada de bases incorporadas erradamente pelo BER, reparo de DSB e SSB por HR. Dentre as vias de reparo acima descritas, a Fotorreativação é um mecanismo de reparo direto que utiliza fotoliases para catalisar a reversão de dímeros de pirimidina em monômeros. Existem vários tipos de fotoliases de acordo com a sua especificidade de substrato. Outro mecanismo que repara as lesões induzidas por UV é o NER, que se subdivide em duas subvias: Reparo do Genoma Global e Reparo Acoplado a Transcrição. O T. brucei possui dois genes da fotoliase, um nuclear codificador da fotoliase criptcromo DASH e outro mitocondrial codificador da CPD fotoliase I. No entanto, o T. cruzi possui apenas o gene da fotoliase mitocondrial criptcromo DASH. No presente trabalho estudamos o efeito da irradiação, por luz UV, em T. cruzi selvagens, T. cruzi superexpressor do gene da fotoliase nuclear de T. brucei, T. cruzi deficientes no gene CSB (heminocaute) e T. cruzi heminocaute no gene CSB que superexpressa o gene da fotoliase nuclear de T. brucei. Os resultados obtidos mostraram que o T. cruzi que superexpressa o gene fotoliase nuclear de T. brucei são mais resistentes à radiação UV do que o tipo selvagem. Outro dado importante é que as células selvagens, quando colocadas por 60 minutos sob a luz branca, após tratamento com luz UV, não retornam o crescimento. Não se verificou a mesma atividade em células deficientes no gene CSB. Esses dados sugerem que a fotoliase de T. brucei é funcional e a sua atividade é dependente da ação do gene CSB.