| Summary: | === Infectious laryngotracheitis (ILT) is a respiratory disease of chickens that has worldwide distribution resulting in severe economic losses. In November 2010, the Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA) notified the MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento) a suspicion of the disease in the southern state of Minas Gerais, which later was confirmed. The municipalities involved, included Itanhandu, Pouso Alto, Passa Quatro, Itamonte and Pedralva, belonging to the Highlands of Mantiqueira. Some epidemiological data were collected, necropsies of birds with respiratory clinical signs were performed and samples from larynx, trachea, lung, conjunctiva, turbinates and sinuses, trigeminal ganglia and brain of 78 chickens from laying hens farms in the area where the outbreak occurred were collected. Samples from the same tissues from 12 backyard chickens and laryngotracheal swabs from other 21 commercial chickens of this region were also collected. Additionally, tissue samples were collected from 18 chickens in other regions of the Minas Gerais state. Immunohistochemistry on 30 out 78 tissues from commercial laying hens was performed using a monoclonal antibody specific for the protein gJ. For DNA extraction, formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissues from 78 commercial laying hens, eight backyard chickens and chickens from other regions of Minas Gerais state were used. Also, laryngotracheal swabs were made and used for DNA extraction. Later, polymerase chain reactions (PCR) were made using primers that amplify a product of 237 base pairs corresponding to a region of reversed diploid gene ICP4. Two FFPE and two swabs samples were sent for sequencing and aligned to other strains deposited in GenBank. Clinical signs were characterized by difficulty breathing, coughing, sneezing, nasal discharge, sometimes bloody, apathy and in some birds, swelling of the sinuses and conjunctiva. Mortality varied from 1% to 6% between different farms. At necropsy, some chickens had diffuse moderate acute fibrinous laryngitis and tracheitis; others had acute laryngitis and tracheitis fibrino-necrotic (diphtheric membrane) or formation and accumulation of yellowish necrotic material obstructing the larynx. Fibrinonecrotic lesions were also observed in the sinuses and conjunctiva. Histopathology revealed lesions characteristic of ILT in 25/78 (32%) larynx and trachea, characterized by hyperplasia and desquamation of the epithelium and fusion of epithelial cells forming syncytia containing intranuclear inclusion body. In 15/78 (19%) birds were observed syncytial cells with intranuclear inclusion body in the paranasal sinuses, and in 24/78 (30%) birds these cells were also observed in the conjunctiva. In the lung, 21/78 (26%) birds had ILT characteristic lesions. In the immunohistochemistry, positive marker was detected in the cytoplasm of syncytia cells, which inclusion body cells were visualized and also in some no syncytial cells of the four tested tissues. For PCR test, we observed a higher sensitivity for the diagnosis of ILT compared to histopathology. Samples sent for sequencing had 100% identity with United States (EU104910.1) strain, 99% with Australia (JN596963.1) strain and 91% with vaccine strains CEO (JN580316.1) and TCO (JN580315.1) strains. The tissue with more incidences of ILT characteristics lesions was the larynx/trachea. Nevertheless, lesions also were observed in the lungs and sinuses followed by conjunctiva. Validation of PCR on FFPE tissues offers the advantage of allowing the test tissue fixed by formalin, which enables retrospective and conservation alternative where there is no appropriate freezing. The sequence alignment of ILT BRASIL/2011/UFMG (KC182579) showed some differences in nucleotide that determined differences in the level of amino acid sequences (mutations) compared to the TCO and CEO vaccine strains. However, future sequencing of larger regions of the ICP4 gene should be made to determine if there is relation between the strain involved in the outbreak in southern LTI MG and other wild and vaccine strains. === A laringotraqueíte infecciosa (LTI) é uma doença do aparelho respiratório de galinhas que possui distribuição mundial sendo responsável por grandes perdas econômicas. Em novembro de 2010, o Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA) notificou pela primeira vez ao MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento) uma suspeita da doença no sul do Estado de Minas Gerais que posteriormente foi confirmada nos municípios Itanhandu, Pouso Alto, Passa Quatro, Itamonte e Pedralva, pertencentes às Terras Altas da Mantiqueira. Alguns dados epidemiológicos foram coletados e realizadas necropsias de aves com sinais clínicos respiratórios e coletadas amostras de laringe, traqueia, pulmão, conjuntiva, conchas e seios nasais, gânglio trigêmio e encéfalo de 78 galinhas de granjas de postura comercial da região onde ocorreu o surto. Amostras dos mesmos tecidos de 12 galinhas de subsistência e suabes laringotraqueais de outras 21 galinhas dessa região também foram coletadas. Além disso, foram coletadas amostras de tecidos de 18 galinhas de outras regiões do Estado de Minas Gerais. A imuno-histoquímica foi realizada em tecidos de 30 das 78 aves de postura comercial utilizando um anticorpo monoclonal específico para a glicoproteína gJ do envelope viral. Para a extração de DNA, foram utilizados tecidos fixados em formol e embebidos em parafina das 78 galinhas de postura comercial, de 8/12 galinhas de subsistência, 10/18 galinhas de outras regiões do Estado de MG e também das amostras de suabes laringo-traqueais. A reação em cadeia pela polimerase (PCR) foi realizada utilizando primers que amplificam um produto de 237 pares de base correspondentes a uma região diplóide invertida do gene ICP4. Duas amostras fixadas e duas de suabe foram encaminhadas para sequenciamento e alinhadas a outras cepas depositadas no GenBank. Os sinais clínicos caracterizaram-se por dificuldade respiratória, tosse, espirros, secreção nasal, por vezes sanguinolenta, apatia e em algumas aves, aumento de volume dos seios paranasais e da conjuntiva. A mortalidade observada variou de 1% a 6% entre as diferentes granjas. À necropsia, algumas aves apresentaram laringite e traqueíte fibrinosa aguda difusa moderada; outras apresentaram laringite e traqueíte fibrino-necrótica (diftérica) aguda moderada além de formação e acúmulo de material necrótico amarelado obstruindo a laringe. Foram observadas também lesões fibrinonecróticas nos seios nasais e conjuntiva. Na histopatologia, observou-se lesão caracteristica de LTI em 25/78 (32%) laringes e traqueias, caracterizadas por hiperplasia e descamação do epitélio e fusão de células epiteliais formando sincícios contendo corpúsculo de inclusão intranuclear. Em 15/78 (19%) aves observaram-se células sinciciais com corpúsculo de inclusão intranuclear nos seios paranasais e, na conjuntiva de 24/78 (30%) aves, essas células também foram observadas. Nos pulmões, observou-se lesão característica de LTI em 21/78 (26%) aves. Na imuno-histoquímica, detectou-se marcação positiva no citoplasma de sincícios com corpúsculo de inclusão e também em algumas células aparentemente normais nos quatro tecidos testados- laringe/traqueia, conjuntiva, pulmão e seios paranasais. Observou-se maior sensibilidade da PCR no diagnóstico de LTI quando comparado à histopatologia. As estirpes enviadas para sequenciamento tiveram 100% de identidade com uma estirpe dos Estados Unidos (EU104910.1); 99% com uma da Austrália (JN596963.1) e 91% com estirpes vacinais CEO (JN580316.1) e TCO (JN580315.1). O tecido onde se observou maior incidência de lesões características de LTI foi a laringe/traqueia; porém, além de lesões na traqueia, observou-se também em várias aves lesões nos pulmões, seguidos pelos seios nasais e conjuntiva. A validação da PCR em material fixado em formol e embebido em parafina oferece a vantagem de permitir o teste em tecidos fixados por formol, que viabiliza estudos retrospectivos e alternativa de conservação onde não há congelamento adequado. O alinhamento da sequencia LTI BRASIL/2011/UFMG (KC182579) mostrou algumas diferenças em nível de nucleotídeos que determinaram também diferenças em nível de aminoácidos (mutações) quando comparada às sequencias das estirpes vacinais TCO e CEO. Porém, sequenciamentos futuros de regiões maiores do gene ICP4 devem ser feitos para determinar se há correlação entre a estirpe envolvida no surto de LTI no sul de MG e outras estirpes selvagens e vacinais.
|
|---|
