Análise imunológica e anátomo-patológica de cães naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi tratados com antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas nanométricos e alopurinol

• Main Author: Izabela Ferreira Gontijo de Amorim
• Other Authors: Wagner Luiz Tafuri
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Minas Gerais 2012
• Online Access: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-99QGQJ

=== Leishmania are intracellular obligate parasites that reside predominantly in mononuclear phagocyte cells of vertebrate hosts. In the Americas, dogs (Canis lupus familiaris) are considered the main domestic reservoirs for human visceral leishmaniasis (HVL). In Brazil, the measures proposed for the LV control, consider early diagnosis and treatment of human cases, residual spraying insecticides to combat the insect vector and dogs serological survey, with following euthanasia of positive animals. However, dogs euthanasia is not sustained by economic, social and ethical concerns. The treatment of infected dog with conventional therapy is questionable thus use of liposomal formulations with leishmanicidal activity is a promising strategy. Added to this, the co-treatment with leishmaniostatic drugs represents a good strategy in canine visceral leishmaniasis (CVL) treatment. In our study, treated dogs were divided in six groups as follow: Group I composed by eight dogs treated with meglumine antimoniate encapsulated in liposomes (LMA) associated with allopurinol (Allop) denominated LMA+Allop; Group II composed by eight dogs treated with LMA; Group III composed by eight dogs treated with allopurinol (Allop); Group IV composed by eight dogs treated with empty liposome (LEMP) associated with Allop denominated group LEMP+Allop; Group V composed by eight dogs treated with LEMP. Group VI composed by twelve dogs treated with saline solution (SG). The recommended therapeutic protocol consisted in six administrations every 96h, of 6.5 mg/kg/i.v. LMA; six administrations every 96h, intravenously, into the corresponding volume of empty liposome; and 20mg/kg of allopurinol, once daily for a period of 140 days. Clinical assessments were done before treatment begins, named time (T0) and at moments corresponding to 50, 80, 110, 140, 170 and 201 days after establishment of treatment (T50, T80, T110, T140, T170 and T201). Similarly, peripheral blood samples were collected at time T0, T60, T140 and T200. The procedure was peripheral blood mononuclear immunostaining cells with anti-CD11b, anti-MHCII, anti-TL-2, anti-CD4 and anti-CD8 evaluated by the flow cytometry technique. Skin biopsies, of the inside region of the right pina, were collected at T0, T60, T140. In T200 samples of skin, liver, spleen, superficial cervical lymph nodes were collected during necropsy, which was processed for routine histological evaluations. Semi-quantitative and qualitative histologic studies and parasitism evaluation (immunohistochemistry) were performed using conventional optical microscopy. The Allop group concerning mainly associated with LMA promoted significantly reduced parasitis load (skin, liver and spleen) and clinical improvement of all animals. However, despite this improvement, in dogs studied, was not observed immune response modulation (CD4/CD8 lymphocyte population frequency). Furthermore, the TLR-2 and CR3 expression, in CD14+ monocytes, despite variations observed, along the kinetics of different treatment protocols, did not correlate with the clinical picture. Allopurinol treated dogs mainly associated with LMA showed remission of dermatological classic signs of LVC. Those Allop group, mainly LMA associated showed histological alterations decreased mainly characterized by a lower chronic dermatitis frequency. Allopurinol treated dogs and meglumine antimoniate encapsulated in liposomes treated groups showed significantly lower relative liver weight than in the empty liposomes group. Allopurinol treated dogs with the various associations and treated dogs with encapsulated meglumine antimoniate liposomes when compared to empty liposomes group, showed a decrease of intralobular hepatic granulomas number and hepatic chronic signs. Meglumine antimoniate encapsulated liposomes group associated with allopurinol showed significantly lower in relative weight of the spleen than in the allopurinol-treated group and control. The treatment in the different experimental conditions did not showed significantly alteration in conventional splenic lesions as white pulp T-dependent deplation zone that was observed in most animals studied. The LMA+Allop and Allop groups showed a significant sinnus medullary cellularity reduction as compared to the empty liposome group with a lower trend tissue parasitism. We could say that the animals under different therapeutic protocols, despite the clinical and parasitological improvement, must be accompanied by a longer period of time, since histological changes such as fibrosis and degeneration were mainly found in the liver of LMA + Allop and Allop groups. === As leishmanioses constituem um complexo de enfermidades que atingem o homem, causadas por protozoários flagelados intracelulares obrigatórios que residem predominantemente em células do sistema mononuclear fagocitário dos hospedeiros vertebrados. Nas Américas, os cães (Canis Lupus familiares) são considerados os principais reservatórios domésticos para a leishmaniose visceral (LV) humana. No Brasil, as medidas preconizadas, referentes ao controle da LV, consideram o diagnóstico precoce e tratamento dos casos humanos; aspersão de inseticidas residuais, para combate do inseto vetor, e inquérito sorológico dos cães, com posterior eutanásia daqueles soropositivos. Entretanto, a eliminção dos cães, por muitos, não é aceita por questões econômicas, sociais e éticas. O tratamento do cão infectado, com a terapêutica convencional é discutível, assim, a utilização de formulações lipossomais carreando fármacos com ação leishmanicida constitui uma estratégia promissora. Somado a isso, o co-tratamento com fármacos com ação leishmaniostática constituem uma boa estratégia no tratamento da leishmaniose visceral canina (LVC). Dessa forma, nesse estudo, foram utilizados quarenta e seis cães naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi, classificados como sintomáticos. Esses foram alocados, aleatoriamente, em seis grupos experimentais: grupo antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas nanométricos (Ant); grupo lipossomo vazio (LipV); grupo antimoniato de meglumina encapsulado em lipossoma associado ao alopurinol (Ant+Alo); grupo lipossoma vazio associado ao alopurinol (LipV+Alo); grupo alopurinol (Alo) e controle (C), sendo esse último mantido como controle da infecção. O protocolo terapêutico preconizado consitiu em seis administrações, a cada 96h, por via endovenosa, de 6,5mg/Kg de antimoniato de meglumina encapsulado em lipossomas nanométricos; seis administrações, a cada 96h, por via endovenosa, em volume correspondente de lipossomas nominados vazios; sendo que, metade dos cães, de cada um dos grupos supracitados, receberam conjuntamente 20mg/Kg de alopurinol, uma vez ao dia, por um período de 140 dias. Outro grupo recebeu apenas o alopurinol, por um período similar ao anterior. Avaliações clínicas foram realizadas antes do início do tratamento, nominado tempo (T0) e nos momentos correspondentes a 50, 80, 110, 140, 170 e 201 dias após o início do tratamento (T50, T80, T110, T140, T170 e T201). De forma semelhante, amostras de sangue periférico foram coletadas no momento T0, T60, T140 e T200. Procedeu-se à imunomarcação das células mononucleares do sangue periférico com anticorpos anti-CD11b, anti-MHCII, anti-TL-2, anti-CD4 e anti-CD8 avaliados pela técnica de citometria de fluxo. Biópsias de pele, da face interna da pina direita, foram coletadas nos momentos T0, T60, T140. No T201 amostras de pele, fígado, baço e linfonodo cervical superficial foram coletadas durante a avalição necroscópica e processadas para avaliações histológicas rotineiras. Estudos semi-quantitativos das alterações histológicas e qualitativas do parasitismo tecidual (imuno-histoquímica) foram realizados utilizando-se microscópia optica convencional. O tratamento envolvendo o alopurinol (Alo) principalmente associado ao antimonial pentavalente encapsulado com lipossomos manométricos (Ant+Alo) promoveu significativa redução do parasitismo tecidual (pele, fígado e baço) e melhora clínica de todos os animais. Entretanto, apesar dessa melhora não houve modulação da resposta imune do tipo celular (frequência da população linfocitária CD4/CD8) nos cães estudados. Alem disso, a expressão de CR3 e TLR-2 nos monócitos CD14+, apesar das variações observadas ao longo da cinética do diferentes protocolos de tratamento, não apresentaram correlação com o quadro clinico. Esses mesmos grupos (Alo e Ant+Alo) mostraram remissão dos sinais dermatológicos clássicos da LVC; além de diminuição das alterações histológicas na pele caracterizada principalmente pela menor frequência de dermatite crônica. Quando comparado ao grupo LipV, esses grupos apresentaram peso relativo do fígado significamente inferior. Cães tratados com alopurinol, com as diversas associações, e cães tratados com antimoniato de meglumina encapsulado com lipossomos manométricos, quando comparados ao grupo de cães tratados com lipossomas vazios, apresentaram diminuição no número de granulomas intralobulares hepáticos caracterizando uma resolusão da hepatite crônica. Cães do grupo Ant+Alo apresentaram peso relativo do baço significamente menor em relação ao grupo Alo e C. O tratamento nas diferentes condições experimentais não interferiu significativamente nas lesões esplênicas clássicas como a depleção da área T-dependente da polpa branca, evidenciada microscopicamente na maioria dos animais estudados. Cães do grupo Ant+Alo e Alo apresentaram uma redução significativa da celularidade dos seios medulares em comparação ao grupo LipV, com tendência a um menor parasitismo tecidual. Podemos dizer que os animais sob os diferentes protocolos terapêuticos, apesar da melhora clínica e parasitológica, devam ser acompanhados por um maior período de tempo, visto que alterações histológicas como fibrose e degeneração foram notadamente encontradas no fígado dos animais tratados com antimoniato associado ao alopurinol e alopurinol sozinho.