| Summary: | === Trypanosoma cruzi is a parasite of the Kinetoplastida order, endemic in Latin America, where it causes Chagas disease in humans. An interesting aspect of its biology is its population structure, composed of strains with highly differential features. The T. cruzi genome is highly complex, rich in repetitive elements and containing a large number of multi-copy gene families. However, little is known about the mechanisms involved in the maintenance of such a complex genome and only few
genes involved in DNA metabolism in this parasite have been characterized. Our work was intended to contribute to the understanding of this important aspect of the parasite biology, i.e., how genetic variability is created and, at the same time, how the integrity of the parasite´s genetic material is preserved. Two key genes involved with those
processes were studied: Rad51, because of its crucial role in DNA recombination and DNA polymerase , which codes an enzyme of base excision repair. We have shown that T. cruzi Rad51 gene interferes with the recombination machinery of eukaryotic cells, causing an increase in the rate of these events in a mammalian cell line transfected with the T. cruzi gene. Furthermore, the Rad51 gene can be associated with the T. cruzi response to DNA lesions caused by radiation because exposition to this agent provokes an increase in Rad51 mRNA levels. The T. cruzi gene encoding DNA polymerase is able to complement bacteria cells deficient in DNA polymerase I when expressed as a fusion with the MBP gene. It is also able to perform in vivotranslesion synthesis in these bacteria. The DNA synthesis capability of the recombinant protein was confirmed in vitro using the MBP-DNA pol protein fusion, and it was shown to present a characteristic low fidelity synthesis. Using a non-radioactive assay developed by us, we tested the DNA pol enzymatic activity under different conditions. It was also possible to verify that the recombinant TcDNA pol is able to insert modified nucleotides such as azidothymine (AZT) triphosphate and didesoxinucleotide triphosphate in DNA, which is an enzymatic activity characteristic of
the polymerase X family. Because treatment of T. cruzi epimastigote cultures with AZT results in parasite death, we inferred that TcDNA pol may be one of the enzymes responsible for incorporating this drug into the parasites genome. Here, we have characterized the Rad51 and DNA pol genes of T. cruzi contributing to better understand their roles in its DNA metabolism. === O Trypanosoma cruzi é um parasito da ordem Kinetoplastida, endêmico da América Latina sendo um grave problema social por causar uma doença debilitante, a doença de Chagas. Um aspecto interessante de sua biologia é a estrutura populacional composta por cepas com características muito diferenciadas. Uma grande contribuição para o entendimento da estrutura populacional desse organismo vem do projeto genoma da cepa CL Brener de T. cruzi. A descrição desse genoma mostra que ele é altamente complexo, rico em repetições e com muitas famílias gênicas. Entretanto, pouco se conhece a respeito da manutenção desse genoma e poucos genes envolvidos no metabolismo do DNA foram caracterizados. Nesse trabalho, pretendemos contribuir para o entendimento da forma como esse parasito garante a integridade de seu material genético. Para isso, dois genes chaves no processo de manutenção do genoma foram estudados. O primeiro deles, chamado Rad51, é conhecido em outros eucariotos por seu envolvimento no processo de recombinação. O alto grau de conservação desse gene entre os eucariotos permite que o gene Rad51 do T. cruzi interfira na recombinação de células eucarióticas causando um aumento na taxa desse processo. Além disso, ele pode ser associado à resposta do Trypanosoma cruzi frente a lesões no DNA causadas pela radiação uma vez que a exposição à mesma provoca um aumento no nível de mRNA desse gene.
Isso pode estar relacionado também a alta taxa de sobrevivência desse parasito e a reconstituição de seus cromossomos após tal tratamento. O segundo gene codifica para a DNA polimerase , uma enzima que participa do reparo por excisão de base e possui capacidade de realizar síntese diante de alguns tipos de lesão. O produto desse gene em fusão com a MBP é capaz de exercer a função da DNA polimerase I
em bactérias deficientes nessa proteína. Nesse mesmo sistema, ele também é capaz de realizar síntese translesão. A habilidade de síntese foi confirmada in vitro utilizando a proteína de fusão MBP-DNA pol . Essa proteína teve também sua atividade enzimática testada sob diferentes condições permitindo assim a caracterização de suas condições ótimas de funcionamento. Foi possível notar que a DNA pol é capaz de inserir nucleotídeos como azidotimina (AZT) trifosfato e didesoxirribonucleotídeos trifosfato no DNA, uma característica típica de polimerases da família X. O AZT também causa a morte de T. cruzi e a DNA pol pode ser uma das enzimas responsáveis por isso. Uma outra característica dessa enzima é a sua baixa fidelidade durante o processo de síntese que pode ser um mecanismo de geração de mutações. Esse trabalho inicia um longo caminho na definição do papel da DNA polimerase e Rad51 no metabolismo de DNA do Trypanosoma cruzi. Nesse trabalho, foram caracterizados os genes Rad51 e da DNA pol contribuindo para melhor entender seus papéis no metabolismo de DNA.
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