Diagnóstico da Leishmaniose Visceral utilizando proteínas de Leishmania infantum com função desconhecida

• Main Author: Aliani Moura Fonseca
• Other Authors: Helida Monteiro de Andrade
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Minas Gerais 2013
• Online Access: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-975K5U

=== Leishmania (Ross, 1903) is a protozoan parasite of major medical and veterinary importance. Visceral Leishmaniasis (VL), also known as kala-azar, is characterized by high fever, substantial weight loss, splenomegaly, hepatomegaly and anemia. Can lead to death if unt reated. The species causing the disease in Brazil are L. infantum (L. chagasi). The VL was primarily zoonosis characterized as rural disease. More recently, it is expanding into medium and large urban areas and has become increasing public health problem in Brazil. The dog is identified as reservoir for L. infantum, due to its susceptibility to infection and high parasitic skin. The epidemiological control of VL in Brazil involves the elimination of seropositive dogs, use of insecticide in houses and peridomestic regions and the systematic treatment of human cases. Serological tests frequently used for screening dogs are: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and Immunofluorescence Antibody Test (IFAT). However, these techniques have limitations regarding reproducibility and specificity. During the last years, our group has developed a proteomic study of L. infantum in the search for new diagnostic targets that are more sensitive and specific for detecting both acute and chronic infection. This assay allowed us to identify, among others, hypothetical proteins with potential use in the diagnosis of Canine Visceral leishmaniasis (CVL) that were used for the realization of this project. We selected two hypothetical proteins (C8, C1) were produced recombinantly, using as the vetor plasmid Pet -TeV and expression system as Escherichia coli, BL-21 strain. After purification by affinity chromatography, proteins were used as antigens in serological testing for VL by ELISA. In ELISA with canine serum, C8 antigen had a sensitivity of 75% and specificity of 90%, while the C1 antigen had a sensitivity of 80% and specificity of 60%. On the other hand, in ELISA with human sera, antigens were not efficient to differentiate positive and negative pacients. Furthermore, because we are working with uncharacterized proteins of Leishmania, polyclonal antibodies were produced in rabbits for later use in assays of expression and cellular localization. === Leishmania (Ross, 1903) é um parasito protozoário de grande importância médica e veterinária. A Leishmaniose Visceral (LV), também conhecida como Calazar, é caracterizada por febre alta, substancial perda de peso, esplenomegalia, hepatomegalia e anemia. Pode levar à morte se não tratada. A espécie causadora da doença no Brasil é L. infantum (L. chagasi). A LV era, primariamente, uma zoonose caracterizada como doença eminentemente rural. Nos últimos anos, vem se expandindo para áreas urbanas de médio e grande porte e se tornou crescente problema de saúde pública no Brasil. O cão é identificado como reservatório de L. infantum, devido a sua susceptibilidade para a infecção e pelo alto parasitismo na pele. O controle epidemiológico da LV no Brasil envolve a eliminação de cães soropositivos, uso de inseticida nas casas e regiões do peridomicílio e o tratamento sistemático de casos humanos. Os testes sorológicos usados freqüentemente para triagem dos cães são: o Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) e o Immunofluorescence Antibody Test (IFAT). Contudo, essas técnicas apresentam limitações quanto à reprodutibilidade e especificidade. Durante os últimos anos, nosso grupo vem desenvolvendo um estudo proteômico de L. infantum para a busca de novos antígenos para métodos diagnósticos que sejam mais específicos e capazes de detectar tanto a fase aguda quanto a crônica da infecção. Esse ensaio nos permitiu identificar, dentre outras, proteínas hipotéticas com potencial uso no diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) que foram utilizadas para a realização do presente projeto. Foram selecionadas duas proteínas hipotéticas (C8 e C1) que foram produzidas de forma recombinante, utilizando como vetor o plasmídeo Pet-TeV e como sistema de expressão Escherichia coli, cepa BL-21. Após a purificação por cromatografia de afinidade, as proteínas foram utilizadas como antígenos no teste sorológico para LV por ELISA. No ELISA com soros caninos, o antígeno C8 apresentou sensibilidade de 75% e especificidade de 90%, enquanto o antígeno C1 apresentou sensibilidade de 80% e especificidade de 60%. Por outro lado, no ELISA com soros humanos, os antígenos não foram eficientes para diferenciar pacientes positivos de negativos. Além disso, por estarmos trabalhando com proteínas não caracterizadas de Leishmania, foram produzidos anticorpos policlonais em coelhos para serem utilizados posteriormente em ensaios de expressão e localização celular.