| Summary: | === Although, the thiamine deficiency (TD) causes lesions and/or dysfunctions in several brain regions, the thalamus and the mammillary bodies are the regions more frequently affected. Thiamine deficiency can lead to behavioral impairments, including memory, learning and motor deficits in both humans and animals models. However, the precise mechanisms underlying these pathological changes are still unknown. To approach this question, we performed four independent experiments whose objectives were to evaluate the effects of TD on: protein expression profiles in the thalamus and the correlation between spatial cognitive performance and the levels of thalamic proteins (Experiment 1); hippocampal synapsin I and phosphorylated synapsin I levels and the rats performance during spatial task (Experiment 2); ama-amminobutiric acid (GABA) and glutamate levels in various brain regions and motor aspects (Experiment 3); in vivo GABA, glutamate and acetylcholine release and the rats performace during spontaneous alternation task (Experiment 4). The TD treatment was similar in all experiments and consisted of treating the animals with thiamine deficient diet associated with daily pyrithiamine (inhibitor of the enzyme that produces the active phosphorylated form of thiamine-TTP) injections. Controls animals received thiamine-deficient chow associated to daily injections of thiamine (Experiments 2 and 4) or standard chow combined with saline injections (Experiments 1 and 3). In the Experiment 1 behavioral aspects were assessed using Morris Water Maze (MWM) test and protein expression of thalamus was analyzed using two-dimensional electrophoresis gel. Seven protein spots were found to be differentially regulated as a function of TD: three increased and four decreased (p < 0.05). Regression analysis between the concentrations of each one of these seven proteins and latencies to find the platform in the MWM revealed a significant correlation with four speficic proteins (p<0.05). The data suggest that the process of neurodegeneration induced by severe TD involves alterations (both up and down regulation) in specific proteins within the thalamus. In the Experiment 2 we used the spontaneous alternation task to evaluate working memory. Western blot was performed to analize hippocampal synapsin I and phosphorylated synapsin I levels. Positive correlations between spontaneous alternation behavior and hippocampal levels of synapsin I or phosphorylated synapsin I were found only in control rats. However, spontaneous alternation performance was impaired in PTD rats (p=0.01) and was accompanied by a significant reduction (30%) in phosphorylated synapsin I (p=0.02). These data suggest thiamine deficiency degrades the link between spatial behavior and hippocampal synapsin I and phosphorylated synapsin I protein levels. In the Experiment 3 motor coordination and balance in rodents were evaluated using rotarod and beam balance tasks and excitatory and inhibitory neurotransmitters concentrations in the hippocampus were assessed using HPLC. There was no effect of thiamine deficiency on the assessed motor aspects. The DT reduced the levels of glutamate in the cerebellum (p=0.02) and the levels of GABA in the hippocampus (p=0.01) and cerebellum (p=0.01). On the other hand, the glutamate and GABA levels in prefrontal cortex and striatum were not affected by TD. Thus, thiamine and/or its derivatives seem to play a specific role in the maintenance of levels of GABA and glutamate in some regions of the CNS. Because this effect is region-specific, it might not be related to the role of this vitamin as a coenzyme in energy metabolism. That is, it seems to involve a different mechanism of action. In the Experiment 4, Using HPLC, the GABA, glutamate and acetylcholine hippcampal levels were measured in vivo before, during and after spontaneous alternation task. There were significant effects of thiamine deficiency on the glutamate (p= 0.03) and acetylcholine (p=0.01) release over the phases. In addition, positive correlation between spontaneous alternation behavior and the amount of acetylcholine released during the performance of the maze task was found. There was a tendency (p=0.07) to correlation between the amounts of acetylcholine and glutamate released. These data show that the hippocampus cholinergic and glutamatergic system are involved in the spatial learning and memory events. In conclusion, the present data show thalamic protein changes and hippocampal neurochemical dysfunction associated with behavioral changes in animal model of severe thiamine deficiency, contributing to clarify part of the mechanisms underlying this disorder. === A deficiência de tiamina (DT) leva a perdas celulares e/ou disfunções em várias regiões do encéfalo, sendo o tálamo e os corpos mamilares as regiões mais frequentemente afetadas. Tanto em modelos experimentais como em seres humanos, episódios de DT podem causar, entre outros sinais/sintomas, hipoatividade motora e prejuízos cognitivos. Entretanto, os mecanismos moleculares responsáveis pelas disfunções bioquímicas e lesões cerebrais associadas aos déficits cognitivos e motores continuam obscuros. Visando contribuir com o entendimento desses fatores, foram realizados quatro experimentos independentes cujos objetivos foram avaliar os efeitos da deficiência grave de tiamina sobre: perfil proteômico do tálamo e a relação entre o desempenho em tarefa cognitiva espacial e níveis de proteínas talâmicas (Experimento 1); níveis hipocampais de sinapsina I e fosfo-sinapsina I, e o desempenho de ratos durante tarefa cognitiva espacial (Experimento 2); níveis de GABA e Glutamato em diferentes regiões do Sistema Nervoso Central (SNC) e desempenho de ratos durante tarefas de coordenação e equilíbrio motor (Experimento 3); liberação in vivode glutamato, GABA e acetilcolina no hipocampo e desempenho de ratos durante tarefa de alternação espontânea (Experimento 4). A indução do modelo de deficiência grave de tiamina foi similar em todos os experimentos e consistiu no tratamento dos animais com ração deficiente de tiamina e injeções diárias de piritiamina (inibidor da enzima responsável pela síntese da forma ativa da tiamina: tiamina difosfato-TPP). Animais dos grupos controles receberam ração DT e injeções diárias de tiamina (Experimentos 2 e 4) ou ração padrão e injeções diárias de salina (Experimento 1 e 3). No Experimento 1 o desempenho cognitivo dos animais foi avaliado através do Labirinto Aquático de Morris (LAM) e o perfil de proteínas do tálamo por eletroforese bidimensional. Os dados mostraram que, das proteínas detectadas nas condições utilizadas (1ª e 2ª dimensões: faixa de pH 3,0-11,0 e gel de poliacrilamida 12,5%, respectivamente), sete apresentaram níveis alterados (p< 0,05) em animais DT. Dessas proteínas alteradas, três mostraram-se quantitativamente aumentadas e as outras quatro reduzidas em relação ao controle. Análises de regressão linear entre as concentrações de cada uma dessas sete proteínas e a latência para encontrar a plataforma no Labirinto Aquático de Morris mostrou correlações significativas (p<0,05) direta com uma ou inversa com três delas. Os dados sugerem que o processo de neurodegeneração induzido por DT envolve up and down regulation em proteínas talâmicas específicas e que os níveis dessas proteínas parecem ter um papel no processo de aprendizagem e memória espacial. No Experimento 2, a memória de trabalho foi avaliada através do teste de alternação espontânea. Níveis hipocampais de sinapsina I e fosfo-sinapsina I foram analisados através da técnica de Western Blot. Os resultados mostraram efeitos significativos da deficiência de tiamina sobre as correlações positivas entre porcentagem de alternação e os níveis de sinapsina I e fosfo-sinapsina I. Ou seja, as correlações observadas em ratos controles não foram observadas nos animais DT. O desempenho no teste de memória espacial foi pior em ratos DT (p=0,01) comparado aos controles, sendo este acompanhado por uma redução significativa (30%) nos níveis de fosfo-sinapsina I (p=0,02). Esses resultados indicam que a DT rompe as associações normais entre sinapsina I e fosfo-sinapsina I e desempenho cognitivo dependente do hipocampo. No Experimento 3, aspectos motores foram avaliados através do teste do rotarod e beam balance e os níveis de GABA e glutamato foram avaliados post-morten no cerebelo, estriado, hipocampo e córtex pré-frontal. O desempenho dos animais nos testes motores não foi afetado pela DT. A restrição de tiamina afetou significativamente a concentração de glutamato no cerebelo (p=0,02) e a concentrações de GABA no hipocampo (p=0,01) e no cerebelo (p=0,01). Por outro lado, os níveis de glutamato e GABA no córtex pré-frontal e corpo estriado não foram afectados pela TD. Dessa forma, a tiamina eou seus derivados parecem desempenhar um papel específico na manutenção dos níveis de GABA e glutamato em algumas regiões do SNC. Como esse efeito é região-específica, parece ser diferente da ação relacionada ao papel dessa vitamina como co-enzima no metabolismo energético. No Experimento 4, a liberação in vivo de glutamato, GABA e acetilcolina no hipocampo foi avaliada antes, durante e após tarefa de alternação espontânea, utilizando microdiálise e cromatografia líquida de alta eficiência. A DT afetou de forma significativa a liberação de glutamato (p=0,03) e acetilicolina (p=0,01). Além disso, análises de regressão mostraram uma correlação entre acetilcolina e alternação espontânea (p=0,02) e uma tendência de correlação entre a liberação de acetilcolina e glutamato (p=0,07). Esses dados mostram o envolvimento dos sistemas colinérgico e glutamatérgico do hipocampo em tarefa cognitiva. Concluindo, os dados aqui apresentados além de contribuir para o esclarecimento sobre os componentes dos mecanismos neuroquímicos subjacentes à alterações cognitivas em condições de deficiência de tiamina, também abrem um novo caminho para se entender, em futuros estudos, as bases moleculares do aprendizado espacial.
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