Prevalência de mycobacterium bovis e estudo dos fatores associados entre casos de tuberculose atendidos em centros de referência, Brasil, Março 2008 Fevereiro 2010

• Main Author: Marcio Roberto Silva
• Other Authors: Mark Drew Crosland Guimaraes
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Minas Gerais 2011
• Online Access: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8H2LS8

=== Introduction: Mycobacterium bovis is an organism of the M. tuberculosis complex that causes animal tuberculosis, but can also affect human beings. The relative contribution of Mycobacterium bovis to the global tuberculosis (TB) is likely to be underestimated due to its dysgonic and slow growth characteristics and because of the absence of pyruvate in most used media is unfavorable for its primary isolation. In Brazil Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) cultures, identification and susceptibility tests are performed only in tuberculosis (TB) referral centers, generally for particular cases. Furthermore, solid, egg-based, glycerol-containing (without pyruvate supplementation) Löwenstein-Jensen (LJ) or Ogawa media are routinely used, unfavouring M. bovis isolation. The main objectives of this thesis were: 1) To describe the identification of Mycobacterium tuberculosis complex based on amplification and sequencing of oxyR pseudogene from stored Ziehl-Neelsen-stained sputum smears obtained from patients with pulmonary tuberculosis diagnosed at two public referral laboratories from Juiz de Fora, Minas Gerais State, in 2007 (original article 1); 2) To determine the relative importance of M. bovis to the global tuberculosis in suspected TB referred to the two health centers from Juiz de Fora, Minas Gerais State, from March 2008 to February 2010 (original article 2); 3) To evaluate factors associated with human infections due to M. bovis and atypical mycobacteria (original article 3). The methods for achieving such goals and the results were presented as three original articles and will be summarized respectively. Original article 1: A cross-sectional analysis of stored Ziehl-Neelsen (ZN)-stained sputum smear slides (SSS) obtained from two public tuberculosis referral laboratories located in Juiz de Fora, Minas Gerais, was carried out in order to distinguish Mycobacterium bovis from other members of MTC. A two-step approach was used, (a) oxyR pseudogene amplification to detect MTC; and, subsequently, (b) an allele-specific sequencing based on the polymorphism at position 285 of this gene for distinguishing Mycobacterium bovis from other members of MTC. OxyR pseudogene was successfully amplified in 100 (56.5%) among 177 SSS available from 99 individuals. No molecular profile of M. bovis was found. The multivariate analysis indicated that AFB results and source laboratory were associated (p<0.05) with oxyR pseudogene amplification. AFB++ sputum smears showed more oxyR pseudogene amplification than those with AFB0, possibly due to the amount of DNA. One of the two source laboratories presented a greater chance of oxyR pseudogene amplification, suggesting that differences in sputum conservation between laboratories could have influenced the preservation status of DNA. This study provides evidence that stored-ZN-stained sputum smears can be used for molecular detection of MTC and does not provide evidence of M. bovis being associated with human pulmonary tuberculosis in an urban area of Minas Gerais. Original article 2: A cross-sectional analysis was carried out to determine the relative importance of M. bovis as a public health threat in Juiz de Fora, Minas Gerais. We investigated 1000 specimens (603 suspected TB patients) inoculating their clinical samples onto routine LJ and Stonebrink (SB) pyruvate enriched media. A total of 356 specimens were culture positive for Mycobacterium spp. either in LJ or SB medium and 178 TB cases had the implied micobacteria defined by conventional and/or molecular speciation methods. Among the 178 TB cases, we detect one single M. bovis by conventional methods. But, this case couldnt be confirmed by molecular speciation methods. This sample didnt present either gen pncA or pseudogene oxyR amplifications. Also, supposed DNA present on 38 formalin fixed and paraffin wax embedded biopsy tissue samples from 38 TB patients were oxyR genotyped and 14 were confirmed as TB. Two of them were recognized as M. bovis cases. Our data indicate that M. bovis importance on the burden of human TB in Juiz de Fora, Minas Gerais, Brazil, was low. Three (1,5%) were recognized as M. bovis-M. tuberculosis co-infections out 191 confirmed patients for Mycobacterium spp. infections. Additionally, M. tuberculosis was detected alone in 184 (96.4%) of 191 patients (95% CI = 93.6% - 98.9%), and M. avium-intracellulare evidences alone or in co-infection with M. tuberculosis was found in 4 (2.0%) of 191 patients (95% CI = 0 - 4.1%). Original article 3: We evaluated possible factors associated respectively to M. bovis co-infections (study 1) and M. avium-intracellulare evidences (study 2) by means of two case-control studies nested in a cross-sectional study. In this study mycobacteria involved in 191 patients were defined by conventional and/or molecular speciation methods. We selected 15 controls (TB due to M. tuberculosis) for each M. bovis co-infection or M. avium-intracellulare evidence, respectively. In both studies, controls were matched by age group (cutoff point 38 years) and sex (Study 1) and by age group (cutoff point 38 years), sex and type of entry into service (study 2). In Study 1, M. bovis co-infections were associated (p 0.05) with both a zoonotic exposure (OR=16,85; IC 95% = 0,64-275,18) and the clinical form of TB (OR = 16.00, 95% CI = 1.21 to 209.94). In Study 2, M. avium-intracellulare evidences presented an association (p 0.05) with HIV / AIDS (OR = 13.36, 95% CI = 1.26 to 140.93). === Introdução: Mycobacterium bovis é um agente do complexo M. tuberculosis que causa TB animal, mas que pode afetar também o ser humano, sendo a sua contribuição relativa no contexto global da tuberculose humana (TB) provavelmente subestimada devido às suas características de crescimento disgônico e lento e, à ausência de piruvato na maioria dos meios utilizados que dificulta o seu isolamento primário. No Brasil, cultivos de microrganismos do complexo Mycobacterium tuberculosis (CMT), sua identificação e testes de sensibilidade são realizados apenas em centros de referência em tuberculose (TB), em geral, em casos específicos. Além disso, meios sólidos, à base de ovo, como Löwenstein-Jensen (LJ) ou Ogawa contendo glicerol (sem suplementação de piruvato) são usados rotineiramente, prejudicando o isolamento de M. bovis. Os principais objetivos desta tese foram: 1 - descrever a identificação do complexo Mycobacterium tuberculosis baseada na amplificação e sequenciamento do pseudogene oxyR de esfregaços de escarro corados por Ziehl-Neelsen obtidos de pacientes com TB pulmonar diagnosticada em dois laboratórios de referência da rede pública de Juiz de Fora, Minas Gerais, em 2007 (artigo original 1); 2 - determinar a importância relativa de M. bovis como causa de TB em suspeitos referenciados a dois centros de saúde de Juiz de Fora, Minas Gerais, de março de 2008 a fevereiro de 2010 (artigo original 2); 3 - Investigar fatores associados a infecções humanas por M. bovis e micobactérias não-tuberculosas, respectivamente (artigo original 3). Os métodos para atingir esses objetivos e os resultados foram apresentados em três artigos originais resumidos a seguir. Artigo original 1: Foi realizada uma análise transversal de esfregaços de escarro de lâminas de baciloscopia corados por Ziehl-Neelsen (ZN), provenientes de pacientes com TB atendidos em dois laboratórios públicos de referência de tuberculose localizados em Juiz de Fora, Minas Gerais, objetivando distinguir Mycobacterium bovis de outros membros do CMT. Uma abordagem em duas fases foi utilizada (a) amplificação do pseudogene oxyR para detectar CMT e, posteriormente, (b) sequenciamento alelo-específico baseado no polimorfismo na posição 285 do pseudogene em questão para distinguir Mycobacterium bovis de outros membros do CMT. O pseudogene oxyR foi amplificado com sucesso em 100 (56,5%) de 177 esfregaços disponíveis de 99 indivíduos. Nenhum perfil molecular de M. bovis foi encontrado. A análise multivariada indicou que os resultados de Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR) e o laboratoraório fonte foram associados (p0,05) com a amplificação do pseudogene oxyR. Esfregaços BAAR ++ mostraram maior chance de amplificação do pseudogene oxyR que aqueles com BAAR 0, possivelmente devido à quantidade de DNA. Um dos dois laboratórios de origem apresentaram maior chance de amplificação do pseudogene oxyR, sugerindo que as diferenças na conservação de escarro entre os laboratórios poderiam ter influenciado o estado de preservação do DNA. Este estudo fornece evidências de que lâminas de baciloscopia de escarro coradas por ZN armazenadas podem ser utilizadas para detecção molecular do CMT, mas não forneceu evidências de M. bovis estar associado com tuberculose pulmonar humana em uma área urbana de Minas Gerais. Artigo original 2: Um estudo de corte transversal foi conduzido para determinar a importância relativa de M. bovis na tuberculose humana em Juiz de Fora, Minas Gerais. Foram investigados 1000 espécimes (603 suspeitos de tuberculose), os quais foram inoculados em meios LJ e Stonebrink (SB). Um total de 356 espécimes tiveram cultura positiva para Mycobacterium spp. seja no meio LJ ou no SB e 178 casos de TB tiveram as micobactérias implicadas caracterizadas por métodos convencionais e / ou moleculares (genotipagem do gene pncA). Entre os 178, detectou-se um único caso de M. bovis por métodos convencionais, mas não pôde ser confirmado por métodos moleculares. Uma amostra da cultura da micobactéria não apresentou qualquer amplificação do gene pncA ou do pseudogene oxyR. Adicionalmente, tentou-se a extração do DNA presente em 38 biopsias de 38 suspeitos de TB extrapulmonar e a genotipagem do oxyR e 14 (36,8%) foram confirmados como TB. Dois deles foram reconhecidos como co-infecções de M. bovis. Os dados indicam que a importância relativa de M. bovis no conjunto da TB humana em Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil foi baixa. Três co-infecções de M. bovis-M. tuberculosis (1,5%) foram evidenciadas dentre 191 pacientes que tiveram confirmadas infecções por Mybocabterium spp. (IC95% = 0 - 3,3%). M. tuberculosis foi detectado isoladamente em 184 (96,4%) dos 191 pacientes (IC95% = 93,6% - 98,9%), e evidência de M. avium-intracellulare isoladamente ou em co-infecção com M. tuberculosis foi encontrada em quatro (2,0%) dos 191 pacientes (IC95% = 0 - 4,1%). Artigo original 3: Foram avaliados possíveis fatores associados respectivamente a co-infecções de M. bovis (estudo 1) e evidências de M. avium-intracellulare de forma isolada ou como co-infecções (estudo 2) por meio de dois estudos de caso-controle aninhados em um corte transversal, no qual foram caracterizadas as micobactérias envolvidas em 191 pacientes. Foram selecionados em ambos os estudos 15 controles (TB por M. tuberculosis) por cada co-infecção de M. bovis ou evidência de M. avium intracellulare, respectivamente. Em ambos os estudos os controles foram pareados por faixa de idade (ponto de corte 38 anos) e sexo (estudo 1) e por faixa de idade (ponto de corte 38 anos), sexo e tipo de entrada no serviço (estudo 2). No estudo 1, co-infecções por M. bovis tiveram associação (p 0,05) com uma exposição zoonótica (OR=16,85; IC 95% = 0,64-275,18) e com a forma clínica de TB (OR=16,00; IC 95%=1,21-209,94). No estudo 2, evidências de M. avium-intracellulare, agentes que afetam animais, ocasionalmente seres humanos imunocompetentes e frequentemente imunossuprimidos, apresentou uma associação (p 0,05) com a infecção por HIV/AIDS (OR=13,36; IC 95%=1,26-140,93).