| Summary: | === Visceral leishmaniasis is the most severe form among leishmaniasis. The zoonotic disease, caused by Leishmania infantum, represents 20 % of the world's human visceral leishmaniasis with increasing incidence in urban areas of the tropics. In Brazil, one of the control measures is the identification and elimination of infected dogs. The diagnostic methods used to identify these animals are not able to detect 100 % of them, which may compromise the effectiveness of this control measure . Furthermore, the development of an effective vaccine would be highly desirable. Thus, to contribute to the diagnosis and control of Canine Visceral Leishmaniasis, we aimed to develop and test two new antigens. Previously, we published a work in which ten antigenic peptides were identified in ELISA anti - LVC. In the current proposal, these ten peptides were assembled into a synthetic gene. Furthermore, another twenty peptides were identified as good T cell epitopes in a publication by our group. Similarly, these peptides were joined in a molecule. Both genes have been cloned and expressed in Escherichia coli, producing two chimeric recombinant proteins, PQ10 and PQ20. These antigens have been used in ELISA anti-LVC with a sensitivity of 80.1% (PQ10) and 84.9% (PQ20) and specificity of 65.6% for both. The proteins were able to identify asymptomatic dogs (80%) more effectively than ELISA Biomanguinhos (0%) and DPP® (10%). Moreover, detection of dogs in the beginning of the infection also occurred, with positivities ranging from 23 and 65%, depending upon the phase in which sera was acquired. The proteins were immunogenic in the raising of polyclonal serum in rabbits. With this serum, we found that only a few peptides were the most responsible for the immunogenicity of the chimeric proteins. In mice immunization and in stimulation of canine peripheral blood mononuclear cells, we observed that the proteins stimulate a pattern of Th2 -type immune response, with IL-10 and IL-4 production. In summary, our studies demonstrate that the use of the constructed chimeric proteins based on B cells epitopes has a great potential in immunodiagnosis and can benefit canine visceral leishmaniasis control programs. === A leishmaniose visceral é a mais grave dentre as leishmanioses e sua forma zoonótica, causada por Leishmania infantum, representa 20% da leishmaniose visceral humana mundial. No Brasil, uma das medidas de controle é a identificação e eliminação de cães infectados. Os métodos diagnósticos utilizados para identificação desses animais não são capazes de detectar 100% deles, o que compromete a eficácia dessa medida de controle. Além disso, o desenvolvimento de uma vacina eficiente seria altamente desejável. Dessa forma, visando contribuir para o diagnóstico e o controle da Leishmaniose Visceral Canina (LVC), tivemos o objetivo de produzir e testar dois novos antígenos. Anteriormente, realizamos um trabalho no qual dez peptídeos foram identificados como antigênicos em ELISA para diagnóstico da LVC. Na atual proposta, esses dez peptídeos foram reunidos em um gene sintético. Além disso, outros vinte peptídeos foram identificados como bons epitopos para células T em publicação do nosso grupo. Da mesma forma, esses peptídeos foram unidos em uma molécula. Ambos os genes foram clonados e expressos em Escherichia coli, produzindo duas proteínas quiméricas: PQ10 e PQ20. Esses antígenos foram utilizados em ELISA para LVC com sensibilidades de 80,1% para a PQ10 e 84,9% para a PQ20 e especificidade de 65,6% para ambas. Esses antígenos foram capazes de identificar cães assintomáticos (80% do total) de maneira mais eficiente que o DPP® (10%) e o ELISA Biomanguinhos (0%), testes atualmente utilizados pelo programa de controle da LVC. Além disso, a detecção de cães no início da infecção também ocorreu, com positividades oscilando entre 23% e 65%, de acordo com o período da coleta. Em amostras de soros de uma coorte, a soroconversão ocorreu mais precocemente para as PQs do que para o ELISA Biomanguinhos. As proteínas se mostraram imunogênicas na obtenção do soro policlonal em coelhos. Com esse soro, foi possível identificar que apenas alguns peptídeos são os maiores responsáveis pela imunogenicidade das proteínas quiméricas. Em ensaios de imunização de camundongos e de estímulo de células mononucleares do sangue periférico de cães, foi possível observar que as proteínas estimulam um padrão de resposta imune do tipo Th2, com produção de IL-4 e IL-10. Em suma, nossos estudos demonstram que as proteínas quiméricas construídas com epitopos para células B possuem um grande potencial em imunodiagnóstico, podendo beneficiar programas de controle da leishmaniose visceral canina.
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