| Summary: | === The Kefir grains are similar in structure to pieces of cauliflower, composed by a variety of bacteria and yeast which are firmly bonded and encapsulated by an insoluble polysaccharide matrix,, that are used to produce a sour, slightly alcoholic fermented beverage, called Kefir. Although Kefir grains were originally cultured in milk, other substrates have been used as culture medium (aqueous solution of brown sugar or soy milk). Thus, the aim of this study was to identify and characterize the lactic acid bacteria of kefir grains, using culture-dependent and culture- independent methods. For this purpose, eight samples of kefir grains were obtained from Viçosa (MG), Belo Horizonte (MG), Salvador (BA), Curitiba (PR) and Divinópolis (MG), four grown in water with brown sugar
and four in milk. Ten grams of each sample were diluted and plated on modified MRS agarand M-17 agar. After preliminary identification tests, 117 isolates suggestive of Lactobacillus were submitted to identification by PCR- ARDRA and the species identified were: L. crispatus, L. casei, L. kefiri, L. diolivorans, L. perolens, L. mali, L. satsumensis and L. parafarraginis. Leuconostoc mesenteroides, Oenococcus oeni and Lactococcus lactis were also isolated and identified by the culture-dependent method. Ten grams of four samples of Kefir grains were treated to obtain total DNA, being submitted to PCR and 16S
rRNA gene amplicons obtained were cloned and transformed. Eighty colonies were randomly selected and analyzed by colony PCR using specific primers of the TOPO 2.1 vector. The amplicons of fifty transformant colonies were separately digested with restriction enzymes TaqI and Sau 3AI, for grouping of the samples and subsequent sequencing. Through this culture-independent method, species were identified as follows: L. kefiranofaciens, L. kefiri, L. satsumensis, L. hilgardii, L. mali, L. paracasei, L. nagelii, L. casei, Oenococcus kitaharae, Oenococcus oeni, Enterobacter ludwigii and Klebsiella pneumoniae, and two non-cultivable microorganisms were also identified: uncultured bacterium clone-y OTU2 and uncultured Lactobacillus. Some species of lactobacilli were not recovered by culture-dependente methodbut were detected by culture-independent method. One the other hand, some lactobacilli were cultivated but not detected by cultureindependent
method. These results suggest that bothculture-independent and culturedependent methods areimportant to understand the diversity of lactic acid bacteria in Kefir grains. Besides, food matrix and origin place might interfere with lactic acid bacteria diversityof Kefir grains. === Os grãos de Kefir são estruturas semelhantes a pedaços de couve-flor, constituídos por um conjunto complexo de bactérias e leveduras firmemente aderidas e encapsuladas por uma trama de polissacarídeos insolúveis, utilizados para a produção de uma bebida fermentada, ácida, levemente alcoólica, denominada Kefir. Originalmente os grãos eram
cultivados apenas em leite, mas atualmente outros substratos têm sido utilizados como meio de cultivo (solução aquosa de açúcar mascavo, leite de soja, dentre outros), o que pode alterar a microbiota dos mesmos. Diante disso, este trabalho pretende identificar e caracterizar as bactérias do ácido lático de grãos de Kefir, utilizando métodos dependentes e independentes de cultivo. Para tanto, foram obtidas oito amostras de grãos provenientes de Viçosa (MG), Belo Horizonte (MG), Salvador (BA), Curitiba (PR) e Divinópolis (MG), sendo quatro cultivadas em água com açúcar mascavo e quatro em leite. Dez gramas de cada amostra foram diluídas e plaqueadas em ágar MRS modificado e ágar M-17. Após identificação preliminar, 117 isolados, sugestivos de Lactobacillus, foram submetidos à identificação por PCR-ARDRA, obtendo-se as seguintes espécies: L. crispatus, L. casei, L. kefiri, L. diolivorans, L. perolens, L. mali, L. satsumensis e L. parafarraginis. Foram ainda isolados e identificados Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus lactis e Oenococcus oeni. Posteriormente, o DNA total extraído de dez gramas de quatro amostras de grão de Kefir foi submetido à reação de PCR do gene 16SrRNA e os amplicons obtidos foram clonados e transformados. Aleatoriamente, foram selecionadas 80 colônias que foram analisadas por PCR utilizando primers específicos do vetor TOPO 2.1. Os amplicons gerados de 50 colônias transformantes foram digeridos separadamente com as enzimas
TaqI e Sau3AI, para agrupamento das amostras e posterior sequenciamento. Através desta metodologia, independente de cultivo, foram identificadas as seguintes espécies: L. kefiranofaciens, L. kefiri, L. satsumensis, L. hilgardii, L. mali, L. paracasei, L. nagelii, L. casei, Oenococcus kitaharae, Oenococcus oeni, Enterobacter ludwigii e Klebsiella pneumoniae, sendo também identificados dois microorganismos não cultiváveis: Uncultured bacterium clone y-OTU2 e Uncultured Lactobacillus. Algumas espécies de Lactobacillus não puderam ser cultivadas, mas foram detectadas pelo método independente de cultivo. Outras foram cultivadas, porém não detectadas pelo método independente de cultivo. Este resultado sugere ser importante a utilização de ambos os métodos para o conhecimento da diversidade de bactérias do ácido lático em grãos de Kefir. Além disso, o substrato onde o grão de Kefir é cultivado e o local de origem parecem
interferir na diversidade de bactérias láticas presentes no mesmo.
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