Caracterização genética dos vírus dengue sorotipo 1 isolados em Roraima durante os anos de 2008 a 2010

• Main Author: Debora Dinelly de Sousa
• Other Authors: Pablo Oscar Amézaga Acosta
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Roraima 2013
• Subjects: biologia molecular; dengue; Roraima; sorotipo 1; filogenia; molecular biology; serotype 1; phylogeny; BIOLOGIA GERAL
• Online Access: http://www.bdtd.ufrr.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=262

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === Na região Norte, Roraima destaca-se como um dos Estados hiper-endêmicos para o dengue, com circulação dos quatro sorotipos nos últimos três anos, e com uma elevada incidência da doença na última década. Por outro lado, sua localização geográfica tem um papel importante na entrada de novos genótipos/sorotipos do dengue ao Brasil. O DENV-1, depois de uma breve incursão no estado nos anos de 1981-1982, foi reintroduzido no ano 2000, e tem sido um dos sorotipos mais isolados até o ano de 2011, porém, existem poucos dados que mostram a ocorrência de variabilidade genética ou de alguma evolução na composição genética deste sorotipo durante as infecções ocorridas nos diferentes anos. O objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular do gene do envelope de isolados de DENV-1 durante epidemias ocorridas no período de 2008 a 2010 no estado de Roraima. As amostras foram inoculadas em células da linhagem C6/36 de Aedes albopictus, e identificadas por imunoflorescência indireta e pela técnica de RT-Hemi-Nested-PCR. Para a obtenção de um amplicom da região do envelope, uma RT-PCR foi realizada com o uso de iniciadores específicos, gerando um produto com 1724 pb. Os amplicons foram sequenciados e as sequências consenso foram obtidas usando o programa Geneious v.5.5.4. Para realização da análise molecular, as sequências foram comparadas com sequências referência dos quatro sorotipos do vírus dengue, e dos cinco genótipos do DENV-1 de diferentes partes do mundo, disponíveis no GenBank. A reconstrução filogenética foi realizada por dois métodos, o de Máxima Verossimilhança e o Bayesiano. Todos os isolados foram agrupados no genótipo V do DENV-1. As sequências utilizadas neste estudo apresentaram de 99-100% de similaridade com cepas de DENV-1 de Países e Estado vizinhos, como República Bolivariana da Venezuela, Guiana Inglesa, Colômbia e Amazonas, e se agruparam na árvore filogenética formando um subclado com cepas destes países e com outros da região do Caribe, indicando, mais uma vez, Roraima, como possível via de entrada de sorotipos/genótipos de dengue no país, fato totalmente comprovado quando houve a entrada e dispersão do genótipo II do vírus DENV-4 no ano de 2010. As cepas brasileiras do genótipo V do DENV-1 formaram três linhagens distintas. Os isolados deste estudo (2008-2010) se agruparam na linhagem III, diferente da cepa que circulou no Estado no de 2001, a qual era pertencente à linhagem II. Ao comparar estas sequências, foram encontradas quatro substituições de aminoácidos, duas (E428 e E436) provavelmente neutras que não modificaram a conformação tridimensional do envelope, pois trocaram aminoácidos de características físico-químicas similares (Leucina x Valina; Isoleucina x Valina) e duas substituições (E227 e E338) com alta probabilidade de modificar o envelope (Prolina x Serina; Leucina x Serina). Estes resultados provavelmente indicam uma evolução adaptativa no DENV-1, ou entrada de uma nova linhagem ao Estado, enfatizando a importância do monitoramento molecular de cepas de DENV circulantes em determinada região, permitindo um melhor entendimento do vírus. === In northern Brazil, Roraima is highlighted as one of the dengue virus hyperendemic states, where the four serotypes has been circulating for the last three years and with a high incidence of this disease in the last decade. On the other hand, its geographic localization has an important part on the entry of new genotypes/serotypes of dengue in Brazil. DENV-1, after a short incursion in the state in years 1981 and 1982, was reintroduced in 2000 and it was one of most isolated serotypes until 2011. Nevertheless, there is little data that shows the occurrence of genetic variability or any evolution in genetic composition from this serotype on infections occurred in different years. The objective of this project was to perform a molecular characterization of the envelope gene isolated from DENV-1 on infections occurred between 2008 and 2010 in Roraima. The samples were inoculated in C6/36 cells from Aedes albopictus, and identified by indirect immunofluorescence and RT-Hemi-Nested-PCR techniques. To obtain an amplicom from the envelope region, it was made an RT-PCR test with specific primers, generating a product with 1724 bp. The amplicons were sequenced and the consensus sequences were obtained using the program Geneious V.5.5.4. For molecular analysis, the current sequences were compared to sequences from the four serotypes of dengue virus and also compared to five genotypes of DENV-1 from different parts of the world available on GenBank. The phylogenetic reconstruction was made by two methods, Maximum-likelihood and Bayesian. All of the isolates were grouped in genotype V of DENV-1. The sequences showed 99-100% of similarity with strains of DENV-1 from neighbor countries and states as the Bolivarian Republic of Venezuela, Guyana, Colombia and Amazonas, they were grouped on a phylogenetic tree forming a subclade with strains of these countries and Caribbean region, and besides indicating, once more, Roraima as a possible entry route of serotypes/genotypes of dengue in Brazil, fact totally proven in 2010 with the entry and dispersion of genotypes II of DENV-4. The Brazilian strains of genotype V of DENV-1 formed three distinct lineages. The isolates of this study (2008-2010) were grouped in lineage III, different from the strain that circulated in the state in 2001, which belonged to lineage II. When these sequences were compared, it was found four aminoacid substitutions, two of them (E428 e E436) probably neutral which did not change tridimensional conformation of the envelope, since amino acids with similar physicochemical characteristics were changed (Leucine x Valine; Isoleucine x Valine), and two substitutions (E227 e E338) with high probability of changing the envelope (Proline x Serine; Leucine x Serine). These results may indicate an adaptive evolution of DENV-1 or the entry of a new lineage in the State, emphasizing the importance of molecular monitoring strains of DENV in circulation in certain regions, allowing better understanding of the virus.