Comparação de quatro métodos de PCR para o diagnóstico da leishmaniose viceral canina em amostras coletadas por Swab conjuntival

• Main Author: Marcia Maria Pilatti
• Other Authors: Antero Silva Ribeiro de Andrade
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: CNEN - Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, Belo Horizonte 2009
• Subjects: Leishmaniose visceral; Diagnosticos; Doenças infecciosas; hibridização; Cães; Reação em cadeia da polimerase; Leishmaniasis; Hybridization; Diagnosis; Dogs; Polymerase chain reaction; Infection diseases; PARASITOLOGIA
• Online Access: http://www.bdtd.cdtn.br//tde_busca/arquivo.php?codArquivo=98

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === Muitos estudos já demonstraram a aplicabilidade da reação em cadeia da polimerase (PCR) para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC), cujo agente etiológico no Brasil é a Leishmania (Leishmania) chagasi. Um dos maiores obstáculos para a implementação desta técnica é a falta de padronização. Centenas de trabalhos foram publicados até o momento sobre o diagnóstico por PCR das leishmanioses, mas poucos foram realizados com a finalidade de comparar a eficiência dos diversos protocolos disponíveis. O objetivo deste trabalho foi comparar a sensibilidade de quatro métodos de PCR para o diagnóstico da LVC. As técnicas foram primeiramente testadas usando DNA purificado de promastigotas cultivados e em seguida em amostras coletadas de cães infectados pelo método do swab conjuntival. Todos os métodos de PCR utilizados neste trabalho apresentam duas etapas: amplificação seguida de hibridização ou de uma nova amplificação (nested ou semi nested). Dois dos métodos (kDNA PCR-Hibridização e kDNA snPCR) utilizam iniciadores endereçados aos minicírculos do cinetoplasto (kDNA) e os outros dois métodos apresentam como alvo a região codificante (LnPCR) e intergênica não codificante (ITS1 nPCR) dos genes do RNA ribossômico (RNAr). Quando foi utilizado DNA purificado de L. (L.) chagasi o kDNA snPCR apresentou a melhor sensibilidade detectando até 10 fg enquanto que os outros métodos detectaram até 100 fg. Estes resultados não se correlacionaram bem com os obtidos de cães infectados através do swab conjuntival. Dois grupos de 23 cães foram usados. No Grupo 1 o DNA foi extraído dos swabs pelo método do fenol-clorofórmio e no Grupo 2 por fervura. Para os cães do grupo 1 os métodos mais eficientes foram os baseados em alvos de kDNA. O kDNA PCR-Hibridização detectou parasitas em 22/23 cães (95,6%) e em 40/46 amostras (86,9%), considerando as conjuntivas direita e esquerda. O kDNA snPCR foi positivo para 21/23 cães (91,3%) e para 40/46 amostras (86,9%). As positividades destes métodos foram significativamente superiores as obtidas pelos métodos com alvos nos genes de RNAr (p<0,05). O método LnPCR obteve resultado positivo em 17/23 cães (73,9%) e em 30/46 amostras (65.2%). Já o ITS1 nPCR conseguiu detectar os parasitas em 16/23 cães (69,6%) e 28/46 (60,9%) das amostras. No grupo 2 o método kDNA PCR-Hibridização também mostrou melhor desempenho detectando parasitas em 18/23 cães (78,3%) e em 31/46 amostras (67,4%), resultado significativamente superior (p<0.05) aos outros três métodos. As positividades dos métodos kDNA snPCR e LnPCR foram abaixo do esperado e estes ensaios parecem ter sofrido algum tipo de inibição relacionada ao processo de extração de DNA. A maior sensibilidade dos métodos baseados em minicírculos de kDNA descrita por outros pesquisadores foi confirmada neste estudo. O kDNA PCR-Hibridização mostrou a melhor sensibilidade entre os métodos avaliados, entretanto a escolha do melhor método vai depender do tipo de informação requerida com o diagnóstico. Como um todo, nossos resultados apóiam a aplicabilidade do método do swab conjuntival para diagnóstico da LVC. === Many studies have demonstrated the applicability of Polymerase chain reaction (PCR) for diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL). The disease in Brazil is caused by Leishmania (Leishmania) chagasi. A major concern in the development and implementation of PCR for Leishmania ssp. diagnosis is the lack of standardization. Many works on PCR diagnosis of leishmaniasis have been published, but very few studies have compared different protocols. The aim this work was to compare the sensitivities of four PCR methods for CVL diagnosis. The comparison was firstly accomplished using DNA purified from cultured promastigotas and then using samples collected from infect dogs by the conjunctival swab procedure. All PCR methods presented two steps: a first amplification followed by hybrization or a new amplification (nested or semi nested). Two of the methods (kDNA PCR-Hibridization and kDNA snPCR) used primers addressed to kinetoplast minicircles and the other two methods to the coding (LnPCR) and intergenic noncoding regions (ITS1 nPCR) of the ribosomal rRNA genes. The assessment using purified DNA of L. (L.) chagasi demonstrated that the kDNA snPCR showed the best sensitivity detecting up 10 fg while all other methods detected up to 100 fg. These results did not correlate well with those obtained from infected dogs by the conjunctival swab procedure. Two groups of 23 dogs were used. In Group 1 the DNA was extracted from cotton swabs by phenol-chloroform and in Group 2 by boiling. In the Group 1 the most efficient methods were those based on kDNA targets. The kDNA PCR-Hybridization was able detect parasites in 22/23 dogs (95.6%) and in 40/46 samples (86.9%), considering the right and the left conjunctivas. The kDNA snPCR was positive for 21/23 dogs (91.3%) and for 40/46 samples (86.9%). The positivities of kDNA based methods were significantly higher than the positivities obtained by the two methods based on ribosomal rRNA genes (p<0.05). The method LnPCR was able to detect parasites in 17/23 dogs (73.9%) and 30/46 (65.2%) samples. The ITS1 nPCR was positive for 16/23 dogs (69.6%) and 28/46 (60.9%) samples. In Group 2 the kDNA PCR-Hybridization also showed the best performance. It was able to detected parasites in 18/23 dogs (78.3%) and 31/46 samples (67.4%), significantly higher (p<0.05) than the other three methods. The positivities of two methods, kDNA snPCR, and LnPCR, were below than the expected and these assays seem to be undergone some kind of inhibition related to DNA extraction procedure. The higher sensitivity of the minicircle kDNA based assays reported by others was confirmed in this study. The kDNA PCR-Hybridization showed the best sensitivity among the assays evaluated, however the choice of the best method will depend on the kind of information needed with the diagnosis. As a whole, our results support the applicability of the conjuntival swab procedure for CVL diagnosis.