Comparação entre métodos baseados na PCR, em diferentes amostras clínicas, para o diagnóstico da leishmaniose visceral em cães com sinais clínicos

• Main Author: Aline Leandra Carvalho Ferreira
• Other Authors: Antero Silva Ribeiro de Andrade
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: CNEN - Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, Belo Horizonte 2013
• Subjects: Cães; Diagnostico; Reação em cadeia da polimerase; Dogs; Diagnosis; Polymerase chain reaction; CIENCIAS BIOLOGICAS
• Online Access: http://www.bdtd.cdtn.br//tde_busca/arquivo.php?codArquivo=331

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico === A leishmaniose visceral representa atualmente um grande problema de saúde pública. O cão é o principal reservatório doméstico da Leishmania (Leishmania) infantum, agente etiológico da doença. O diagnóstico correto e seguro da leishmaniose visceral canina (LVC) é muito importante para evitar a ocorrência da doença humana e canina, em destaque também o sacrifício desnecessário de cães. Uma alternativa promissora para o diagnóstico tem sido o uso da PCR (do inglês Polimerase Chain Reaction). No entanto, um dos maiores obstáculos para a implementação desta técnica é a falta de padronização e a determinação da amostra mais adequada. Poucos trabalhos foram realizados com a finalidade de comparar a sensibilidade dos diversos protocolos e amostras. O objetivo deste trabalho foi comparar a sensibilidade de cinco métodos de PCR frente a 4 tipos de amostras clínicas no diagnóstico da Leishmania infantum em cães com sinais clínicos. Os diferentes métodos de PCR foram direcionados para alvos distintos do DNA. O kDNA PCR hibridização, kDNA snPCR e a PCR em tempo real utilizaram iniciadores endereçados aos minicírculos do DNA do cinetoplasto (kDNA) e os outros dois métodos apresentam como alvo a região codificante (LnPCR) e intergênica não codificante (ITS1 nPCR) dos genes do RNA ribossomal (RNAr). As amostras clínicas de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival foram avaliadas neste estudo. As amostras de swab conjuntival apresentaram baixo teor de contaminantes que favoreceu as amplificações, confirmando a importância deste protocolo de extração, previamente desenvolvido por nosso grupo de pesquisa. No ITS1 nPCR foi observado 97% de positividade nas amostras de medula óssea (29/30), seguido pelo swab conjuntival e pele com 83% (25/30) e o sangue periférico com 70% (21/30). Na comparação dos resultados caninos do LnPCR a medula óssea apresentou maior positividade (90%) 27/30 animais, seguida da pele com 83,3% (25/30), swab conjuntival 73,3% (22/30) e do sangue periférico com 70% (21/30). O desempenho do kDNA snPCR para as amostras de sangue foi de 50% de positividade (15/30), seguida da pele com 67% (20/30), 80% (24/30) com a utilização do swab conjuntival e 83,3% (25/30) com a medula óssea. Das 30 amostras de sangue periférico, apenas 46,6% foram positivas (14/30) no kDNA PCR hibridização (utilizando sondas marcadas com 32P), enquanto as amostras de pele obtiveram 64% de positividade (19/30), seguida pela medula óssea com 83,3% (25/30) e swab conjuntival 96,6% (29/30). A PCR em tempo real revelou os melhores resultados com 100% de amplificação para as amostras de pele, medula óssea e swab conjuntival, sendo apenas 3/30 animais nas amostras de sangue periférico negativos neste método. A quantificação foi realizada em parasitos por 20 ng/μL de DNA total, quantidade utilizada em todas as reações de PCR em tempo real. No sangue periférico houve uma variação de 0,003 a 0,55 parasitos, nas amostras de pele foram encontrados de 0,004 a 89,74, na medula óssea a variação foi de 0,001 a 118 e no swab conjuntival de 0,0002 a 22,91. Este estudo apontou a PCR em tempo real associada ao swab conjuntival como a melhor opção no diagnóstico molecular da LV em cães apresentando sinais clínicos da infecção. === Visceral leishmaniasis is currently a majorpublic health problem. Dogs are the main domestic reservoir of Leishmania (Leishmania) infantum, the etiological agent of the disease. The correct and safe diagnosis of the canine visceral leishmaniasis (CVL) is very important to prevent the occurrence of the human and canine disease, also highlighted the unnecessary culling of dogs. A promising alternative for diagnosis has been the use of PCR (Polymerase Chain Reaction). However, a major obstacle to the implementation of this technique is the lack of standardization and the selection of the most appropriate sample. Few studies have been performed comparing the sensitivity of different protocols and samples. The objective of this study was to compare the sensitivity of five PCR methods against 4 types of clinical samples for the diagnosis of Leishmania infantum in dogs with clinical signs. The different PCR methods used primers addressed to distinct DNA targets. The kDNA PCR hybridization, kDNA snPCR and real time PCR used primers addressed to minicircle of the DNAs kinetoplast (kDNA) and the other two methods for the coding (LnPCR) and non-coding intergenic spacer regions (ITS1nPCR) from ribosomal RNA genes (rRNA). Clinical samples of peripheral blood, skin, bone marrow and conjunctival swabs were evaluated in this study. Conjunctival swab samples showed low levels of contaminants that allowed high-quality amplifications, confirming the value of the extraction protocol previously developed by our research group. The ITS1 nPCR showed 97% of positivity in bone marrow samples (29/30) followed by conjunctival swab and skin with 83% (25/30) and the peripheral blood with 70% (21/30). In the comparison of the canine results of LnPCR the bone marrow showed 90% (27/30) of positivity, followed by skin with 83.3% (25/30), conjunctival swab 73.3% (22/30) and peripheral blood 70% (21/30). The kDNA snPCR presented 50% (15/30) of positivity for blood samples, 67% (20/30) for skin, 80% (24/30) using the conjunctival swab and 83,3% (25/30) for bone marrow. The kDNA hybridization PCR (using 32P labeled probes) allowed 46.6% (14/30) of positivity for peripheral blood, 64% (19/30) for skin biopsies, 83.3% (25/30) for marrow bone and 96.6% (29/30) by conjunctival swabs. The real time PCR revealed the best results with 100% amplification for skin biopsies, bone marrow and conjunctival swab samples, and only 3/30 animals for peripheral blood samples were negative by this method. Quantitative results were expressed as number of parasites per 20 ng of DNA, amount used in all real time PCR reactions. A range from 0.003 to 0.55 parasites were found in peripheral blood samples, 0.004 to 89.74 in the skin biopsies, 0.001 to 118 in bone marrow and 0.0002 to 22,91 parasites in conjunctival swabs. This study pointed the real time PCR combined with conjunctival swab as the best option in the molecular diagnosis of VL in dogs with clinical signs of infection.