DEVELOPMENT OF SPECTROFLUORIMETRIC METHODS FOR DETERMINATION OF ERYTHROMYCIN AND KANAMYCIN AND THEIR APPLICATION IN THE YELLOW FEVER VACCINE

• Main Author: VIRGINIA DE LOURDES MENDES FINETE
• Other Authors: RICARDO QUEIROZ AUCELIO
• Language: Portuguese
• Published: PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO 2005
• Online Access: http://www.maxwell.vrac.puc-rio.br/Busca_etds.php?strSecao=resultado&nrSeq=7620@1; http://www.maxwell.vrac.puc-rio.br/Busca_etds.php?strSecao=resultado&nrSeq=7620@2

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO === Os antibióticos eritromicina e canamicina, pertencentes às classes dos macrolídeos e aminoglicosídeos respectivamente, têm sua importância como agentes preservativos no processo de preparação e durante o processo de utilização da vacina contra a febre amarela - apresentação de cinco doses - produzida no Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Bio-Manguinhos, FIOCRUZ, RJ. Este trabalho propõe apresentar duas novas abordagens para a determinação espectrofluorimétrica desses antibióticos, considerando o desempenho, inclusive com relação à seletividade, na análise dessa matriz específica (vacina). Um estudo preliminar do comportamento luminescente (fosforescência e fluorescência) dessas substâncias foi realizado em diferentes condições experimentais a fim de encontrar as que permitissem o desenvolvimento dos métodos analíticos. Para a eritromicina, que não apresentou luminescência nativa, foi utilizado um procedimento de derivação fotoquímica de soluções do analito preparadas em meio contendo ácido sulfúrico. Como resultado obteve-se um foto-produto que apresentou fluorescência em 412/465 nm. As condições experimentais foram otimizadas visando a maximização desse sinal fluorescente. Nesse caso, foram estudados o tempo de irradiação com UV, o tipo e a concentração do ácido utilizado, o tempo e a temperatura de aquecimento. O método foi parcialmente validado apresentando limites de detecção e de quantificação iguais a 0,25 ug mL-1 e 0,85 ug mL-1 respectivamente. A faixa linear do método estendeu-se até 200 ug mL-1 e os parâmetros de precisão e robustez foram bastante satisfatórios. O método foi aplicado na análise de uma simulação de vacina contra a febre amarela e na análise de medicamentos comerciais com um percentual de recuperação entre 98,2 e 105,2 %. A metodologia desenvolvida para a canamicina, que também não apresentou fluorescência natural, baseou-se na reação de oxirredução deste composto com o Ce (IV) produzindo o Ce (III), que é uma espécie fortemente fluorescente (255/360 nm). As intensidades dos sinais fluorescentes medidos no par excitação/emissão do Ce (III) foram diretamente proporcionais às concentrações de canamicina. As condições para a realização da reação foram estudadas, avaliando a quantidade de Ce (IV), a concentração e tipo de ácido usado no meio reacional e o tempo e temperatura de aquecimento. A ampla faixa linear (até 1000 ug mL-1) foi obtida, com limites de detecção e quantificação de 1,22 ug mL-1 e 4,08 ug mL-1, respectivamente. O percentual de recuperação obtido na análise da vacina diluída foi de 109,8 % e em amostra diluída de urina enriquecida com o analito foi de 103,4 %. === The antibiotics erythromycin and kanamycin, members of the macrolide and aminoglycoside classes respectively, have their importance as preservative agents for the preparation process and during the using of the yellow fever vaccine, five doses presentation, produced in Technology on Immunobiologicals Institute, Bio- Manguinhos, FIOCRUZ, RJ. In this work two new approaches for the spectrofluorimetric determination of these antibiotics are presented, taking into consideration their selectivity performance for this specific matrix (vaccine). A preliminary study was performed to evaluate the luminescent behavior (phosphorescence and fluorescence) of these substances in different experimental conditions aiming to find the best ones that would lead to the development of the analytical methods. For erythromycin, which does not present native luminescence, a photochemical derivatization was employed using analite solutions prepared in sulfuric acid. As a result, a photo- product was obtained, which presented fluorescence at 412/465 nm. The experimental conditions were optimized aiming the maximization of the fluorescent signal. In this case, the studied parameters were the UV irradiation time, the type and concentration of the acid utilized, and the time and temperature used for the heating step. The method was partially validated, indicating limits of detection and quantification of 0.25 ug mL-1 and 0.85 ug mL-1, respectively. The linear dynamic range of the method extended up to 200 ug mL-1 and the parameters related to precision and robustness were very satisfactory. The method was applied in the analysis of a simulated yellow fever vaccine and in commercial pharmaceutical formulations. Recovery percent between 98.2 and 105.2 % were achieved. The methodology developed for kanamycin, which also do not presented natural fluorescence, was based on the oxirreduction reaction of this compound with Ce (IV), producing Ce (III), a strongly fluorescent species (255/360 nm). The fluorescence intensities, measured in the excitation/emission pair of Ce (III), was directly proportional to the kanamycin concentration. The reaction conditions were studied by the evaluation of the amount of Ce (IV), the type and concentration of the acid utilized in reactional medium and heating time and temperature. Large linear range (up to 1000 ug mL-1) was obtained, with detection and quantification limits of 1.22 ug mL-1 and 4.08 ug mL-1, respectively. The recovery percent obtained in the analysis of a diluted vaccine was 109.8 % while the recovery achieved for diluted spiked urine was 103.4 %.