DEVELOPMENT OF AN ANALYTICAL METHOD FOR THE DETERMINATION OF TMSB, SB(V) AND SB(III) IN CLINICAL SAMPLES BY IC-ICPMS

• Main Author: FLAVIA DE ALMEIDA VIEIRA
• Other Authors: NORBERT FRITZ MIEKELEY
• Language: Portuguese
• Published: PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO 2003
• Online Access: http://www.maxwell.vrac.puc-rio.br/Busca_etds.php?strSecao=resultado&nrSeq=4472@1; http://www.maxwell.vrac.puc-rio.br/Busca_etds.php?strSecao=resultado&nrSeq=4472@2

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO === A administração de antimoniais no tratamento da leishmaniose é uma rara oportunidade para estudar o metabolismo de antimônio e das suas espécies químicas. Tais estudos são de grande relevância, uma vez que não se tem conhecimento sobre os metabólitos formados no corpo humano e da sua possível importância na erradicação dos parasitas causadoras da doença, assim como sobre os mecanismos de eliminação deste elemento tóxico. Ao contrário do arsênio, existem poucas metodologias reportadas para a análise de especiação de antimônio em amostras clínicas. O presente trabalho é uma continuação de pesquisas realizadas e publicadas anteriormente, nas quais a técnica de espectrometria de massas (ICPMS) acoplada à cromatografia iônica de alta eficiência IC-(HPLC) foi utilizada para separação e quantificação, em linha, de antimoniato de N-metil glucamina, Sb(V) e Sb(III) em amostras de plasma e urina. Assim, serão apresentados resultados recentes obtidos com o emprego de uma coluna com melhor resolução (Metrosep - A Supp5; 250 mm x 4,0 mm; Metrohm, Suíça) na separação de trimetil antimônio (TMSb), Sb(V) e Sb(III). Testes de otimização mostraram que uma solução de EDTA (0,006 mol L-1, pH 4,7) é adequada como fase móvel para a separação das três espécies. Os tempos de retenção para TMSb, Sb(V) e Sb(III) foram de 44,2 s, 150,6 s e 548,4 s, respectivamente, permitindo uma perfeita e repetitiva (DPR <3 por cento) separação dessas espécies. Repetitividades melhores que 4 por cento foram também obtidas na quantificação das áreas dos três picos cromatográficos correspondentes. Curvas analíticas, construídas a partir de soluções padrão das espécies em solução aquosa e em amostras de urina fortificadas, apresentaram ótima linearidade com coeficientes de correlação maiores que 0,999. Para volumes de amostra de 100 uL, injetados na coluna e utilizando-se o espectrômetro ELAN 5000 (PE-Sciex, EUA) como detector multielementar, em combinação com o nebulizador concêntrico tipo Meinhard e uma câmara ciclônica, limites absolutos de quantificação de 0,02 ng de antimônio foram obtidas para as três espécies estudadas. Testes de estabilidade mostraram que Sb(V) sofre alterações químicas já em intervalos de tempo relativamente curtos (maiores que 8h em água, e que 4h em urina fortificada) enquanto que TMSb e Sb(III) evidenciaram estabilidades consideravelmente maiores em ambos os meios. === Clinical applications of antimonials in the treatment of leishmaniasis are a unique opportunity to study the metabolism of antimony and its species in the human body. As little is known about antimony metabolism, studies are required to improve the knowledge about the excretion mechanism of this toxic element; in particular, those which deal with antimony metabolites and the action of antimonials for the eradication of leishmaniasis causing parasites. In contrast with its chemical analogue arsenic, only a few methods concerning antimony speciation in clinical samples have been described in the literature. The aim of the present work was to improve a method previously developed to separate and quantify N-methyl meglumine antimoniate, Sb(V) and Sb(III) in blood plasma and urine samples by using anion exchange high performance liquid chromatography (IC-HPLC) coupled with inductively-coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). Results on the application of an ion chromatography column (Metrosep - A Supp5; 250 mm x 4.0 mm; Metrohm, Swiss) with better resolution for the separation of TMSb, Sb(V) and Sb(III) are presented. The optimum conditions for the separation of the three species were established with 0.006 mol L-1 EDTA at pH 4.7 as the mobile phase. The retention times for TMSb, Sb(V) and Sb(III) were 44,2 s, 151,6 s and 548,4 s, respectively. A robust linear relationship between concentration and peak area was obtained for the three species, both, in aqueous standard solutions and spiked urine samples, with an associated correlation factor higher than 0,999. Relative standard deviations below 4 percent have been obtained in the peak area quantification mode. When using the ELAN 5000 (PerkinElmer-Sciex, EUA) equipped with a concentric Meinhard nebulizer in combination with a cyclonic spray chamber as detector, and employing a 100-uL injection loop in the HPLC system, typical absolute limits of quantification were 0.02 ng of Sb for each of the three antimony species studied. Stability tests showed that Sb(V) suffers chemical alterations within a short time period (>8h in aqueous solutions and >4h in spiked urine), whereas TMSb and Sb(III) presented better stability conditions in both solutions.