STEADY STATE AND TIME RESOLVED FLUORESCENCE STUDIES OF LOCAL ANESTHETICS AND FLUOROQUINOLONE ANTIBIOTICS

• Main Author: FABRICIO CASAREJOS LOPES LUIZ
• Other Authors: SONIA RENAUX WANDERLEY LOURO
• Language: Portuguese
• Published: PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO DE JANEIRO 2009
• Online Access: http://www.maxwell.vrac.puc-rio.br/Busca_etds.php?strSecao=resultado&nrSeq=15676@1; http://www.maxwell.vrac.puc-rio.br/Busca_etds.php?strSecao=resultado&nrSeq=15676@2

CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO === Durante as últimas décadas tem-se acentuado o desenvolvimento de técnicas de fluorescência e suas aplicações em biociências e biotecnologia. Dada sua alta sensibilidade de detecção, tais técnicas têm-se tornado ferramentas importantes em muitas áreas de pesquisa tais como diagnósticos médicos, análise genética, mapeamento estrutural de células, estudos de fármacos, caracterização de complexos de fármacos com metais, análise da interação de fármacos com proteínas, lipídeos e DNA. Os anestésicos locais são fármacos que bloqueiam reversivelmente a condução nervosa quando aplicados a uma região circunscrita do corpo. Entretanto, possuem uma variedade de efeitos nos sistemas biológicos que não somente os efeitos de anestesia. Os antibióticos fluorquinolonas são agentes antimicrobianos sintéticos utilizados clinicamente há mais de 30 anos. Além de sua atividade antibacteriana, algumas fluorquinolonas vêm sendo aplicadas no desenvolvimento de drogas anticancerígenas e anti-HIV. O pH local de muitos meios biológicos tem grande influência nas propriedades espectroscópicas de muitos fármacos. Suas constantes de ionização, pKa, podem ser obtidas experimentalmente através de medidas espectroscópicas tais como absorbância, intensidade de fluorescência e parâmetros da fluorescência resolvida no tempo. Neste trabalho estudamos a partir da técnica de fluorescência estacionária e fluorescência resolvida no tempo os anestésicos locais dibucaína e tetracaína. Estudamos também os antibióticos norfloxacina e levofloxacina e seus respectivos complexos com ouro. Determinamos os tempos de vida de fluorescência e descrevemos ainda como as propriedades espectrais de fluorescência que se alteram em função do pH. Nos estudos de decaimento da fluorescência, desenvolvemos expressões para os fatores pré-exponenciais e as intensidades fracionárias de fluorescência como função do pH para amostras fluorescentes que sofrem transição ácido-base. Mostramos que os valores de pKa são aparentemente deslocados e obtivemos as expressões para o deslocamento. Determinamos as constantes de ionização, pKa, a partir da fluorescência estacionária e de parâmetros associados aos tempos de vida e testamos as expressões teóricas nos resultados experimentais. Os valores obtidos foram coerentes para as constantes de ionização dos fármacos dibucaína, levofloxacina e norfloxacina. Acredita-se que a ação dos anestésicos locais deve-se à interação das moléculas do anestésico com lipídeos e/ou proteínas de membrana. Uma análise desta interação mostra-se necessária para se investigar a difusão do anestésico na membrana e seu efeito na organização e dinâmica dos lipídeos e proteínas que constituem a membrana. Investigamos a interação da dibucaína e tetracaína com membranas enriquecidas em Na,K-ATPase e a incorporação do fármaco à membrana. Determinamos as constantes de associação. O valor obtido para a dibucaína foi de 0.91 × 10(3) M(-1) e para a tetracaína 0.77 × 10(3) M(-1). Estudamos a acessibilidade dos triptofanos por supressão de fluorescência do triptofano pela dibucaína, obtivemos uma acessibilidade de 90% para os triptofanos e uma constante de supressão dinâmica de 4.3 × 10(4) M(-1). === During the last decades the development of fluorescence techniques and their applications in bioscience and biotechnology has been accentuated. Due to high sensitivity, such techniques have become important tools in many research areas such as medical diagnosis, genetic analysis, structural mapping of cells, drug investigation, characterization of drug-metal complexes, analysis of drugs interaction with proteins, lipids and DNA. The local anesthetics are drugs that reversibly block the nervous impulse when applied to a limited region of the body. However, they possess a variety of additional effects in the biological systems. The fluoroquinolone derived antibiotics are synthetic antimicrobial agents that have been used clinically for more than 30 years. In addition to their antibacterial activity, some fluoroquinolones have been applied in the development of anticancer drugs and anti-HIV. The local pH of many biological environments has great influence in the spectroscopic properties of many drugs, including local anesthetics and fluoroquinolones. The ionization constants of the drugs, pKa, can be experimentally obtained via spectroscopic parameters such as absorbance, fluorescence intensity, and time-resolved fluorescence parameters. In this work we studied the local anesthetics dibucaine and tetracaine using steady state and time resolved fluorescence techniques. We also studied the antibiotics norfloxacin and levofloxacin and their complexes with gold. We determined the fluorescence lifetimes and described how the spectral fluorescence properties alter as a function of the pH. In the studies of fluorescence decay, we developed expressions for the pre-exponential factors and the fractional fluorescence intensities as a function of the pH for a fluorophore undergoing an acid-base transition. We showed that the pKa values are apparently shifted and obtained the expressions for the pK shifts. We determined the ionization constants, pKa from steady state fluorescence and from parameters associated with the lifetimes, and we tested the theoretical expressions using the experimental results. The observed pK shifts for dibucaine, levofloxacin and norfloxacin were found to agree with the theoretical expressions. The action of local anesthetics is believed to involve the interaction of the anesthetic molecules with lipids and/or membrane proteins. An analysis of this interaction is necessary to examine the anesthetic diffusion in the membrane and its effect in the organization and dynamics of the membrane lipids and proteins. We investigated the interaction of dibucaine with Na,K-ATPase enriched membranes, and the incorporation of the drug in the membrane. We determined the binding constants. The obtained values were 0.91 × 10(3) M(-1) for dibucaine and 0.77 × 10(3) M(-1) for tetracaine. We also studied the accessibility of the tryptophan residues using the fluorescence quenching by dibucaine. We obtained a dynamic quenching constant of 4.3 × 10(4) M(-1).