| Summary: | Orientadora: Prof. Dra. Marcella Pecora Milazzotto. === Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. === A maturação de oócitos in vitro é amplamente utilizada para produção de embriões e tenta
mimetizar as condições fisiológicas foliculares, permitindo a capacitação oocitária. No
entanto, as condições foliculares a que os oócitos estão submetidos previamente a aspiração
podem ser responsáveis por diferenças que serão refletidas no fenótipo embrionário. O
objetivo deste trabalho foi quantificar marcadores metabólicos no fluido folicular (FF) e
transcritos das células da granulosa (CG) de bovinos envolvidos na capacitação do oócito e
sua relação com a competência embrionária (avaliada pela cinética e desenvolvimento a
blastocisto). Para isso, foram aspirados individualmente complexo cumulus-oocito (COCs) e
respectivos FFs e CG de folículos de 7-8mm de ovários de abatedouro comercial. As
moléculas de glicose, colesterol, estradiol e piruvato foram quantificadas nos FFs por
fluorimetria e os transcritos de receptor de FSH (FSH-R), receptor de angiotensina II
(AngIIAT2), receptor de EGF (EGF-R) e aromatase (CYP19A) foram quantificados nas CG
por RT-PCR. Os COCs foram fecundados e cultivados individualmente in vitro e os índices
de clivagem e cinética embrionária foram avaliados as 40hpi e índices de blastocistos as
186hpi. Posteriormente os dados de desenvolvimento embrionário foram analisados em
função dos dados dos respectivos FF e CG. Foram realizadas as seguintes comparações: não
clivados x clivados (NCL x CL), clivados rápidos (> 4 células as 40hpi) x clivados lentos (< 4
células as 40hpi) (CLR x CLL), desenvolvimento a blastocisto x bloqueado (BL x NBL),
clivados que se desenvolveram a blastocisto x clivados bloqueados (CLBL x CLNBL) e
blastocistos derivados do grupo rápido x derivados do grupo lento (BLR x BLL). Os dados
foram analisados pelo programa SAS System for Windows pelo teste t de Student, e o nível de
significância de 5%. Não houve diferença entre os índices de CLR e CLL (19,2±3,8% e
25,1±3,8%, respectivamente). Da mesma forma, nenhum dos metabólitos e transcritos
analisados foram distintos entre CLR x CLL, tampouco NCL x CL, a exceção do FSHR, que
foi menos expresso CL, BL e CLBL quando comparados a NCL, NBL e CLNBL. O índice de
BL foi (27,3±3,9%) e maior índice de blastocisto foi para BLR do que BLL (18,5±2,7% e
8,8±2,5%, respectivamente). BL e CLBL apresentaram maior quantidade de piruvato e
colesterol, aumento de CYP19 e, no caso de CLBL, ainda maiores níveis de ANGII e EGF-R
2 quando comparados a NBL e CLNBL. Em relação a cinética de desenvolvimento, CLR e
BLR apresentaram aumento de ANGII e estradiol. Além disso, BLR ainda apresentaram
diminuição de CYP19 e EGF-R, sugerindo uma alta atividade esteroidogênica mais
relacionada à secreção do que com a síntese de esteroides, provavelmente por um efeito
negativo do estradiol no controle da expressão destes genes. Os dados deste estudo permitem concluir que o status folicular tem relação direta com a habilidade do oócito a se desenvolver a blastocisto. Além disso, o aumento da disponibilidade de substrato energético e da capacidade esteroidogênica parece influenciar positivamente a capacitação oocitária. Da
mesma forma, embriões de cinética distinta parecem ser derivados de folículos com atividade
esteroidogênica distinta. === Follicular conditions established prior to aspiration for in vitro maturation may be responsible
for differences that will reflect in the embryonic phenotype. In this work, cumulus-oocyte
complex (COCs) and their respective follicular fluid (FF) were individually aspirated from
slaughterhouse ovaries. Metabolic biomarkers as glucose, pyruvate, cholesterol and estradiol
were quantified in FF by fluorimetry. Specific granulosa cells (GC) transcripts related to
oocyte capacitation and steroidogenic capacity such as aromatase (CYP19A), FSH (FSH-r),
angiotensin II (ANGII AT2) and EGF (EGF-r) receptors were quantified by RT-PCR. Bovine
embryos were produced in vitro following conventional protocols. Embryos were cultured
individually and divided into: Fast (> 4 cells at 40 hpi) and Slow (< 4 cells at 40hpi).
Blastocyst rates and embryonic competence (evaluated through developmental kinetics and
blastocysts rates) were assessed at 186hpi. Embryonic development data was analyzed in
function of FF and GC results by comparing: non-cleaved vs. cleaved (NCL x CL), fast vs.
slow (CLF x CLS), development to blastocyst x blocked (BL x NBL), cleaved that reached
blastocyst stage vs. cleaved that blocked (CLBL x CLNBL) and blastocysts originated from
fast vs. slow (BLF x BLS). Embryonic development, quantification of metabolites and
transcripts were compared by Student t test using SAS for Windows considering á=5%.
Cleavage rates were not different between fast and slow embryos (19.2±3.8% and 25.1±3.8%,
respectively). Except for FSH-r, that was less expressed in CL, BL and CLBL than their
respective counterparts NCL, NBL and CLNBL, all the other metabolites and transcripts did
not present any differences. Total blastocyst rate was 27.3±3.9%, being 18.5±2.7% from BLF
and 8.8±2.5% from BLL groups. BL and CLBL presented higher amounts of pyruvate and
cholesterol, and an increased expression of CYP19 when compared to NBL and CLNBL,
respectively. Also, CLBL presented higher levels of ANGII AT2 and EGF-r than CLNBL,
suggesting that BL and CLBL derived follicles have a greater steroidogenic capacity.
Regarding developmental kinetics, CLR and BLR presented an increase in ANGII AT2 and
estradiol and diminished levels of CYP19 and EGF-R, suggesting an elevated secretion of
steroids. Therefore, BLL, with increased expression of CYP19 and EGF-r under lower levels
of estradiol and ANGII AT2 are preferably directed to the synthesis than secretion of this
hormone. In summary, our results show that follicular status is direct ly related to the oocytes
4 ability to develop to blastocyst. In addition, the increased availability of energy substrates and steroidogenic capacity appears to positively influence the oocyte capacitation. Likewise,
embryos with distinct developmental kinetics seem to originate from follicles with distinct
steroidogenic activity.
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