Produção de sistemas supramoleculares nanoestruturados a partir da complexação de DNA e copolímeros catiônicos com potencial aplicação em terapia gênica

• Main Author: Albuquerque, Lindomar Jose Calumby
• Other Authors: Giacomelli, Fernando Carlos
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: 2016
• Subjects: POLIPLEXOS; ESPALHAMENTO DE LUZ; DNA; POLYPLEXES; LIGHT SCATTERING; PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOCIÊNCIA - UFABC
• Online Access: http://www.biblioteca.ufabc.edu.brhttp://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=105656

Orientador: Prof. Dr. Fernando Carlos Giacomelli === Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. === A internalização celular de acidos nucleicos requer um agente de transfeccao, uma vez que o DNA isolado nao e capaz de atravessar membranas lipidicas. Embora diversos agentes polimericos de transfeccao tenham sido estudados, nenhum dos veiculos de entrega de gene propostos preenche todos os requisitos necessarios para uma terapia eficaz (capacidade de condensar e compactar o DNA, estabilidade em ambiente plasmatico, baixa toxicidade, eficiencia de internalizacao, escape endossomal e liberacao intracelular de material genetico). Nesta direcao, foram produzidos poliplexos a partir da complexacao entre copolimeros cationicos e DNA. Os poliplexos foram preparados a partir de DNA de timo de bezerro (ctDNA) dissolvido em tampao fosfato. Medidas de espectroscopia de correlacao de fluorescencia (FLCS), potencial-¿ê e eletroforese em gel de agarose indicaram complexacao eficiente entre as cadeias de DNA e os copolimeros em bloco PEO113-b-PDEA50 e POEGMA70-b-P(OEGMA10-co-DEA47-co-DPA47). Os copolimeros em bloco foram capazes de condensar as cadeias de DNA em particulas com tamanho desejado para absorcao celular por meio das vias de endocitose (RH ~ 65-85 nm). Os resultados obtidos por AFM, SAXS e SLS sugerem que as estruturas supramoleculares sao esfericas, porem de elevado grau de hidratacao. Os dados de ITC revelaram que a ligacao polimero/DNA e endotermica, e consequentemente o processo e governado por efeitos entropicos. A combinacao dos resultados sugerem que POEGMA70-b-P(OEGMA10-co-DEA47-co-DPA47) condensa as cadeias de DNA de forma mais eficiente do que PEO113-b-PDEA50. Mostrou-se tambem por medidas de espectroscopia de dicroismo circular que a conformacao do DNA permaneceu estavel, mesmo apos a complexacao e os poliplexos se mostraram estaveis em meio plasmatico. Os resultados obtidos de viabilidade celular mostram que ambos os sistemas apresentam baixa citotoxicidade, entretanto ensaios de microscopia e citometria de fluxo mostram que os sistemas nao sao funcionais do ponto de vista de expressao de GFP. Porem, quando estes sistemas sao avaliados na presenca de cadeias polimericas livres de polietilenoimina (PEI) se obtem sucesso nas etapas da internalizacao e transfeccao genica indicando que a presenca de cadeias livres de PEI tem papel fundamental nos processos. === PThe intracellular delivery of nucleic acids requires a vector system as they cannot diffuse across lipid membranes. Although polymeric transfecting agents have been extensively investigated, none of the proposed gene delivery vehicles fulfills all the requirements needed for an effective therapy namely ability to bind and compact DNA into polyplexes, stability in serum environment, endosome-disrupting capacity, efficient intracellular DNA release and low toxicity. Accordingly, investigations aiming at safe and efficient therapies are still essential to achieve clinical success of gene therapies. Polyplexes based on the complexation between DNA and cationic copolymers have been produced. The polyplexes were prepared by previously dissolving DNA from calf thymus (ctDNA) in phosphate buffer saline. Measurements of FCS, ¿ê-potential and agarose gel electrophoresis indicated the complexation of DNA and some of block copolymer systems, namely PEO113-b-PDEA50 and POEGMA70-b-P(OEGMA10-co-DEA47-co-DPA47). The block copolymers were evidenced to properly condense DNA into particles with desirable size for cellular uptake via endocytic pathways (RH ~ 65-85 nm). The shape and surface morphology of the polyplexes were investigated using SLS, SAXS and AFM and the data suggest that the supramolecular structures are spherical, however, highly swollen by water. The ITC data revealed that the polymer/DNA binding is endothermic and therefore the process in entropically driven. The combo of results supports that POEGMA70-b-P(OEGMA10-co-DEA47-co-DPA47) condenses DNA more efficiently and with higher thermodynamic outputs as compared to PEO113-b-PDEA50. Finally, circular dichroism spectroscopy indicated that the conformation of DNA remained the same after complexation and that the polyplexes are highly stable in serum environment. The cell viability results show that both systems have low cytotoxicity, however microscopy and flow cytometry assays showed that the polymers are poor tranfecting agents themselves. Nevertheless, in the presence of PEI chains, cellular uptake and transfection efficiency are subtantially enhances point out the fundamental importance of positive charges in the processes.