Avaliação da expressão e do papel dos microRNAs mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p durante a infecção pulmonar causada pela bactéria Pseudomonas aeruginosa

• Main Author: TANA, Fernanda de Lima
• Other Authors: ALMEIDA, Leonardo Augusto de
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Alfenas 2017
• Subjects: Pseudomonas aeruginosa; MicroRNAs; Resposta imune; CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOLOGIA GERAL
• Online Access: https://bdtd.unifal-mg.edu.br:8443/handle/tede/988

Pseudomonas aeruginosa é um importante patógeno humano oportunista capaz de causar severas infecções em pacientes imunodeprimidos e em pacientes que apresentam fibrose cística. Para desencadear uma resposta efetiva contra a infecção pela P. aeruginosa é necessário uma primeira linha de reconhecimento desta bactéria pelo sistema imunológico inato. Apesar do desencadeamento da resposta imune inata ser benéfica no controle da infecção pela P. aeruginosa, esta resposta deve ser controlada. Estudos recentes têm começado a esclarecer como os miRNAs desempenham papéis fundamentais na regulação de processos como infecção, resposta imune e inflamação participando da modulação da resposta imune. Dada a relevância da bactéria P. aeruginosa nos processos infecciosos em humanos e estimulados pela necessidade de desvendar os mecanismos de regulação da reposta imune contra esta bactéria, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel do mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p expressos em camundongos infectados pelas cepas ATCC 27853 e PA14 da bactéria P. aeruginosa. Para avaliar o nível de expressão dos mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p e das citocinas IL-1β, IL-6 e IL-12 in vitro, o RNA total foi extraído de células Raw 264.7, macrófagos derivados da medula óssea (BMDM) e de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC) para análise de PCR em tempo real. Após a infecção das células Raw 264.7, BMDMs e BMDCs foi possível observar que a expressão dos miRNAs e das citocinas ocorreu de forma dependente em cada tipo celular infectado. Para as análises in vivo camundongos C57BL/6 foram infectados via intratraqueal com as cepas ATCC 27853 e PA14 de P. aeruginosa para análises de UFCs, RT-qPCR, histopatologia e estereologia. Apenas a cepa PA14 foi recuperada no pulmão e baço dos animais, onde não foi observado variação na expressão do mmu-miR-155-5p nem aumento significativo de uma série de citocinas efetoras. As análises histopatológicas demostraram intenso processo inflamatório difuso apresentando número maior de células inflamatórias, diminuição no número de alvéolos e do volume da estrela quando comparados aos animais não infectados e animais infectados pela cepa avirulenta. No pulmão dos animais infectados com a cepa ATCC 27853, observou-se aumento de expressão de mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p, das citocinas inflamatórias. A identificação das redes de regulação dos miRNAs em estudo mostrou importantes alvos diretos e indiretos associados à resposta imune inata que podem estar comprometidas durante a expressão diferencial de mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p em favorecimento ou em detrimento da resolução da infecção pela P. aeruginosa. Os resultados obtidos até o momento permitem sugerir que a infecção pela P. aeruginosa exerce uma modulação na expressão de miRNAs e consequentemente na resposta imune contra esta bactéria e que a virulência de diferentes cepas de P. aeruginosa influenciam na expressão dos miRNAs mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p, de citocinas pró-inflamatórias e na patologia. Mais estudos são necessários para desvendar os mecanismos pelos quais cepas virulentas da P. aeruginosa conseguem subverter a resposta imune e garantir a sua replicação no hospedeiro. === Pseudomonas aeruginosa is an important opportunistic human pathogen capable of causing severe infections in immunocompromised patients and in patients with cystic fibrosis. To trigger an effective response against infection by P. aeruginosa is required a first line of recognition of this bacterium by the innate immune system. Although the innate immune response is beneficial in the control of P. aeruginosa infection, this response should be controlled. Recent studies have begun to clarify how miRNAs play key roles in regulating processes such as infection, immune response and inflammation by participating in the immune response modulation. Due to the importance of the P. aeruginosa bacterium in infectious processes in humans and stimulated by the need to uncover the mechanisms of regulation of the immune response against this bacterium, the objective of this study was to evaluate the role of mmu-miR-155-5p and mmu-miR-146b -5p expressed in mice infected with strains ATCC 27853 and PA14 of the bacterium P. aeruginosa. To assess the level of expression of mmu-miR-155-5p and mmu-miR-146b-5p and the cytokines IL-1β, IL-6 and IL-12 in vitro, the total RNA was extracted from Raw 264.7 cells, bone marrow derived macrophages (BMDM) and bone marrow-derived dendritic cells (BMDC) for real-time PCR analysis. After infection of the Raw 264.7, BMDMs and BMDCs cells, it was possible to observe that the expression of miRNAs and cytokines occurred in a dependent manner in each infected cell type. For the in vivo analyzes C57BL / 6 mice were infected intratracheally with the strains ATCC 27853 and PA14 of P. aeruginosa for analysis of CFU, RT-qPCR, histopathology and stereology. Only the PA14 strain was recovered in the lungs and spleens of the animals, where no variation in the expression of mmu-miR-155-5p or a significant increase in a series of effector cytokines was observed. Histopathological analyzes demonstrated an intense diffuse inflammatory process, presenting a larger number of inflammatory cells, a decrease in the number of alveoli and the volume of the star when compared to uninfected animals and animals infected by the avirulent strain. In the lung of animals infected with ATCC 27853 strain, increased expression of mmu-miR-155-5p and mmu-miR-146b-5p, of inflammatory cytokines was observed. The identification of regulatory networks of the miRNAs under study showed important direct and indirect targets associated with the innate immune response that may be compromised during the differential expression of mmu-miR-155-5p and mmu-miR-146b-5p in favor or detriment of P. aeruginosa infection. The results obtained to date suggest that the infection by P. aeruginosa exerts a modulation in the expression of miRNAs and consequently in the immune response against this bacterium and that the virulence of different strains of P. aeruginosa influence the expression of miRNAs mmu-miR- 155-5p and mmu-miR-146b-5p, of proinflammatory cytokines and in pathology. Further studies are needed to uncover the mechanisms by which virulent P. aeruginosa strains can subvert the immune response and ensure replication in its host. === Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG