Pesquisa de pátogenos oportunistas em medicamentos tópicos: padronização e análise comparativa de metodologias

• Main Author: VIEIRA, Daniela Cristina de Macedo
• Other Authors: SILVA, Paulo Márcio Faria e
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Alfenas 2015
• Subjects: Reação em cadeia de polimerase; Aciclovir; Bacillus cereus; CIENCIAS DA SAUDE
• Online Access: https://bdtd.unifal-mg.edu.br:8443/handle/tede/745

Com a ampla disseminação da AIDS, uma grande gama de microrganismos tem aparecido como patógenos emergentes, causando importantes infecções em pacientes imunocomprometidos. Por exemplo, Rhodococcus equi, um agente incomum de infecções em humanos, tem sido isolado em pacientes imunocomprometidos. A presença deste microrganismo oportunista em produtos farmacêuticos não tem tido considerável atenção. No presente trabalho, o método de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi comparado com métodos convencionais para rápida detecção de três espécies bacterianas em amostras de cremes tópicos contaminadas artificialmente. As amostras foram incubadas por 24 horas a 37ºC. Depois da incubação em caldo com 10% de tween 20, amostras foram semeadas em meio para crescimento seletivo. Identificação bioquímica de Bacillus cereus e Rhodococus equi foram feitas utilizando o sistemas de identificação API 20E® e API Coryne®, respectivamente. Para identificação de Micrococcus luteus foram utilizados os testes de catalase, oxidase, morfologias das colônias e o sistema Gram. O DNA foi extraído usando o método do fenol-clorofórmio. Os iniciadores utilizados contendo a seqüência específica foram para B. cereus (BC1 e BC2), R. equi (COX-F e COX-R) e para M. luteus (ML-ISR-R e ML-ISR-F) foram utilizados na reação de PCR. Para validação da metodologia molecular, as seqüências dos produtos de PCR foram determinadas e analizadas utilizando-se os programas Blastn e Blastx. Foi observado uma alta similaridade (E .value 0,0) e uma alta identidade ( > 99%) para as bactérias utilizadas neste estudo. Os métodos convencional e de PCR detectaram B. cereus, R. equi e M. luteus em todas as amostras contaminadas artificialmente. O tempo para completar o método de PCR incluindo o preparo de amostras e a amplificação específica do DNA bacteriano foi de 27 horas. Para o método convencional foi necessário de 72 a 96 horas para o isolamento e identificação bioquímica dos microrganismos pesquisados. A rápida detecção de PCR para B. cereus, R. equi e M. luteus mostrada neste trabalho sugerem o uso desta metodologia em controle de qualidade microbiológica de produtos tópicos não estéreis, especialmente utilizados por pacientes imunocomprometidos. === With the ample dissemination of the AIDS, a wide range microorganisms has blunted as emergent pathogens, causing important infection in immunocompromised patients. For example, Rhodococcus equi, an unusual cause of infection in humans, has been isolated from HIV-infected patients. The presence of these opportunistic microorganisms in pharmaceutical products has not receiv considerable attention. In the present work PCR assay were compared with standard microbiological methods for rapid detection of three bacterial species from artificially contaminated sample of topical creams. Artificially contaminated samples were incubated for 24 horas at 37º C. After incubation in broth with 10% tween 20, samples were streaked on seletive growth media. Biochemical identification of Bacillus cereus and R. equi was performed using API 20E® and API Coryne® identification systems, respectivelly. For Micrococcus luteus identification, colony an Gram-stained morphology of the bacterium and the biochemical tests of catalase and oxidase were used.DNA was extracted using phenol-chloroform method. DNA primers containing the specific sequences of the BC1 and BC2 for B. cereus, COX-R and COX-F for R. equi and ML-ISR-F and ML-ISR-F for M. luteus were used for detection in the PCR reaction. In order to validate this methodology, DNA sequences of the products were determined. The sequences of the cloned PCR products were analysed using Blastn and Blastx programs. It was observed a marked similarity (E.value 0,0) and a high identity (> 99%) to the bacteria used in the study. Both the PCR and the standard enrichment tests method detected B. cereus, R. equi and M. luteus in all of the deliberately contaminated samples. The time to complete the PCR assay including sample preparation and PCR amplification of the specific DNA bacterial targets was 27 h. Standard plating methods required 72-96 h for the bacteria to be isolated, purified and biochemecally identified. Rapid PCR detection of B. cereus, R. equi and M. luteus showed in this work suggests the use of this methodology in the microbiology control of non-sterile topical products, specially intended for use with immunocompromised patients.