Regulação da atividade Nox2 de neutrófilos por nitróxidos/

• Main Author: CHAVASCO, Luciana Souza
• Other Authors: BRIGAGÃO, Maísa Ribeiro Pereira Lima
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Alfenas 2015
• Subjects: Inflamação; Neutrófilos; "Burst" respiratório; Radical tiila; Nitróxido; CIENCIAS DA SAUDE::FARMACIA
• Online Access: https://bdtd.unifal-mg.edu.br:8443/handle/tede/668

Espécies reativas de oxigênio (ERO) produzidas por neutrófilos através do complexo Nox2 estão diretamente associadas às ações deletérias surgidas quando a inflamação escapa do controle da homeostase. A produção exacerbada destas espécies é controlada por ações de antioxidantes endógenos como a glutationa (GSH), um importante tripeptídeo redutor que repara biomoléculas oxidadas envolvidas na sinalização celular e atua como “scavenger” de bioradicais. Os nitróxidos são radicais livres, sintéticos e estáveis que apresentam propriedades antioxidantes e antiinflamatórias. Recentemente foi demonstrado que estes são capazes de modular o “burst” respiratório de macrófagos, reduzindo a produção de ânions superóxido (O2•-) gerados pelo complexo Nox2, em um mecanismo no qual atuariam como “scavengers” de radicais tiila (RS•.), alterando modificações proteicas pós-traducionais. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade dos nitróxidos 4-9((- acridinecarbonil)-amino)-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (Ac-Tempo) e 2,2,6,6- tetrametilpiperidina-1-oxil (Tempo) de interagir e indisponibilizar RS•, especialmente glutationila (GS•), modulando a produção de ERO/ERN por neutrófilos inflamatórios isolados da cavidade peritoneal. O “burst” respiratório de neutrófilos estimulados com forbol 12-miristato 13- acetato (PMA) foi monitorado através de técnicas espectrofotométricas e a capacidade de interação entre RS• e nitróxidos foi analisada através de ensaios de Ressonância Paraeletromagnética (EPR) e Espectrometria de Fluorescência. Para confirmar a produção de RS• durante a ativação do complexo Nox2, utilizou-se o agente captador de spin, 5,5- dimetilpirrolina-N-oxido (DMPO) e o sinal de EPR característico do aduto DMPO/GS• foi monitorado. Verificou-se um aumento da resposta de fluorescência, acompanhado pela redução do sinal de EPR do nitróxido em células estimuladas com PMA. Com a finalidade de verificar alterações proteicas pós-traducionais de S-glutationilação os grupos experimentais foram submetidos à técnica de “dot blotting” e o tratamento celular com o nitróxido Tempo 100 μM determinou uma diminuição do processo de S-glutationilação proteica associado à atividade do complexo Nox2. Os resultados apontam os nitróxidos como protótipos de antioxidantes e antiinflamatórios. === Reactive oxygen species (ROS), produced in neutrophils, through the Nox2 complex are directly associated with the deleterious actions that arise when inflammation escapes from the control of organic homeostasis. An exacerbated production of these species is controlled by endogenous antioxidants such as glutathione (GSH), an important tripeptide able to repair oxidized biomolecules involved in cell signaling and to act as a scavenger of bioradicals. The nitroxides are synthetic and stable free radicals which have been frequently reported because of their anti-inflammatory and antioxidant properties. Recently, it was shown that these compounds can modulate neutrophil respiratory burst, reducing the production of superoxide anion generated by the Nox2 complex in a mechanism were they act as scavenger of thiyl radicals (RS•), altering post-translational modification of proteins. The aim of this work was to evaluate the ability of nitroxides 2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (TEMPO) and 4-(9- acridinecarbonylamino)-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (Ac-Tempo) to interact with thiyl radicals, especially glutathionyl (GS•), minimizing the production of reactive oxygen and nitrogen species by inflammatory neutrophils isolated from the peritoneal cavity of mice. The respiratory burst in neutrophils stimulated by phorbol 12-myristate 13- acetate (PMA) was monitored spectrophotometrically and the interaction between thiyl radicals and nitroxides was analyzed by Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and Fluorescence Spectroscopy. To confirm the production of RS• during the activation of the Nox2 complex, the spin trap for GS•, 5,5-dimethylpyrroline-N-oxide (DMPO) was used and the characteristic DMPO/GS• adduct EPR signal was monitored. An increase in the fluorescence response was observed, accompanied by a reduction of EPR signal of nitroxide in cells stimulated with PMA. Posttranslational events such as S-glutathionylation were analyzed through dot blotting and the experimental groups treated with Tempo (100 μM) showed a decrease in the process of Sglutathionylation associated with the activity of the Nox2 complex. These results suggest that thiyl radicals play a role in the maintenance of the neutrophil respiratory burst and may provide a therapeutic target for inflammation management. === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES