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Previous issue date: 2016 === A linagliptina (LGT) é um fármaco inibidor da DPP-4, da classe das gliptinas, utilizado para o controle glicêmico de diabetes mellitus tipo 2. Levando-se em conta que os fármacos utilizados no processo de produção das formulações farmacêuticas não são considerados totalmente puros, alguns Guias Regulatórios (ICH) descrevem a necessidade da quantificação do fármaco e suas impurezas de síntese. Diante disso, o objetivo do estudo é o desenvolvimento de um método por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificação do fármaco e de suas três principais impurezas de síntese e o estudo de segurança biológica destas substâncias. O desenvolvimento e a validação do método para LGT e das três impurezas foram realizados por CLAE acoplada a um detector de arranjo de diodo (DAD), utilizando coluna C8 (5 μm - 4,6x100 mm), fase móvel eluída em modo gradiente, constituída de uma mistura de ácido fórmico 0,1% pH 3,5 e acetonitrila (ACN) eluída com uma rampa crescente de 10% na proporção de ACN de (0) zero ao 4 min (30% para 70%) e decrescente de 10% na proporção de ACN de 5 a 8 min (70% para 30%), vazão de 0,6 mL/min, volume de injeção de 20 μL e temperatura do forno de 30°C. Os comprimentos de onda de detecção utilizados foram 294, 278, 268 e 280 nm para LGT, impureza 1, 2 e 3, respectivamente. O método apresentou-se seletivo e específico para a LGT e as impurezas, pois não houve interferência dos produtos de degradação por Ultravioleta A, hidrólise básica (hidróxido de sódio 1,0 mol/L) e ácida (ácido clorídrico 1,0 mol/L), peróxido hidrogênio 30%, temperatura 60 °C e hidrólise básica e ácida em condições térmicas à 80 °C e dos excipientes na quantificação do fármaco. A resposta foi linear na faixa de 2,41-144,0 μg/mL (r = 0,9996) para a LGT e na faixa de 0,06-3,6 μg/mL para as impurezas testadas (r = 0,9963, 0,9994 e 0,9991 para impureza 1, 2 e 3, respectivamente). O método demonstrou exatidão, com teores de recuperação de 99,79, 93,12, 92,92 e 93,99% para a LGT e impureza 1, 2 e 3, respectivamente. A precisão intra e inter-dia foi satisfatória (RSD 1,36, 4,14, 3,50 e 4,08% para a LGT e impureza 1, 2 e 3, respectivamente) e a robustez não apresentou diferenças significativas com pequenas alterações nas condições analíticas (pH, fase móvel, temperatura, fluxo e detector). A cinética de degradação em condição alcalina associada a temperatura de (80 ºC), apresentou resultados de primeira ordem. A avaliação da segurança biológica foi realizada por meio da citotoxicidade, mutagenicidade e genotoxicidade através dos testes de viabilidade celular, micronúcleo e cometa, respectivamente. Nos testes de segurança biológica a LGT apresentou-se apenas citotóxica na concentração 10 vezes superior a concentração plasmática máxima, enquanto as impurezas 1 e 3 apresentaram-se citotóxica, mutagênica e genotóxica em uma concentração equivalente a 10% concentração plasmática máxima do fármaco e a impureza 2 evidenciou sua citotoxicidade e genotoxicidade na concentração equivalente a 10% da concentração plasmática máxima do fármaco. De acordo com os resultados obtidos, pode-se observar que o método proposto foi indicativo de estabilidade por CLAE para LGT e ainda demonstrou-se adequado para análise quantitativa das impurezas de síntese do fármaco. Além disso, evidenciou-se que a LGT e as impurezas de síntese estão em conformidade com os testes de segurança biológica empregados, desde que utilizadas nas concentrações adequadas. === Linagliptin (LGT) is an inhibitor of DPP4 used for glycemic control of type 2 mellitus diabetes. Since the drugs used in the production process of the pharmaceutical formulations are not considered totally pure, the Regulatory Guides describing the need of the drug quantification and impurities potentials. Therefore, the aim of this study was to develop a method by highperformance liquid chromatography to quantify the drug and three potential synthetic impurities and biological safety studies. The development and validation of the method for LGT and the three impurities were carried out by HPLC coupled to a photodiode array detector. The chromatographic separation was performed in a RP8 column (150 x 4.6 mm, 5 μm), at 30°C. The separation was performed by means of a linear gradient elution (eluent A: formic acid 0.1% pH 3.5; eluent B: acetonitrile). The gradient obeys the following sequence: 3070% of B (0 - 4 minutes) and 7030 of B (4,01 - 8 minutes) at a flowrate of 0.6 mL min1 and run time of 10 minutes. The injection volume was 20 μL and detection at 294, 278, 268 e 280 nm for LGT, impurity 1, 2 and 3, respectively. The method showed selectivity and specific for the LGT and synthetic impurities, therefore no interference of degradation products (UV-A, basic hydrolysis (sodium hydroxide 1.0 mol L1) and acid (hydrochloric acid 1.0 mol L1), peroxide (30%), temperature (60 ° C) and acidic and basic hydrolysis under thermal conditions (80° C)) and the excipients in the quantification of the drug. The response was linear from 2.41 to 144.0 μg mL1 (r = 0.9996) for the LGT and in the range of 0.06 to 3.6 μg mL1 (r = 0.9963, 0.9994 and 0.9991 for impurity 1, 2 and 3, respectively ). The method showed accuracy, with recovery levels of 99.79, 93.12, 92.92 and 93.99% for LGT and impurity 1, 2 and 3, respectively. The intra and inter-day precision was suitable (RSD 1.36, 4.14, 3.50 and 4.08% for LGT and impurity 1, 2 and 3, respectively) and the robustness showed no significant differences with small changes in the analytical conditions (pH of the mobile phase, temperature, flow-rate and detector). The kinetics of degradation in alkaline conditions associated with temperature (80° C), showed results of the first order. The evaluation of the biological was performed by cytotoxicity, mutagenicity and genotoxicity through the cell viability test, micronucleus and comet, respectively. In biological safety testing LGT had only cytotoxic activity at a concentration of 10 times the maximum plasma concentration, while the impurity 1 and 3 set out cytotoxic, mutagenic and genotoxic in a concentration equivalent to 10% maximum plasma concentration of the drug and impurity 2 showed cytotoxicity and genotoxicity in concentration equivalent to 10% of the maximum plasma concentration of the drug. According to the results, it can be seen that the proposed method by HPLC is stability-indicating and suitable for quantitative analysis of the drug and synthetic impurities. Furthermore, it was observed that the LGT and synthetic impurities are in accordance with biological safety studies, if they are used in appropriate concentration.
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