Mechanisms of priming and elongation during ubiquitin chain formation

• Main Author: Lips, Christian
• Other Authors: Sommer, Thomas
• Format: Doctoral Thesis
• Language: English
• Published: Humboldt-Universität zu Berlin 2020
• Subjects: Proteinqualitätskontrolle; Endoplasmatisches Retikulum-assoziierter Proteinabbau; E3-vermittelte E2-Stimulation; "Priming" & "Elongation"; Protein quality control; Endoplasmic reticulum-associated protein degradation; E3-mediated E2 stimulation; Priming & elongation; 572 Biochemie; WD 5100; WD 5080; ddc:572
• Online Access: http://edoc.hu-berlin.de/18452/21781; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-110-18452/21781-7; http://dx.doi.org/10.18452/20959

Die Interaktion von RING-finger-Ubiquitin (Ub)-Ligasen (E3-Enzyme) mit Ub-konjugierenden Enzymen (E2-Enzyme) bestimmt wie schnell ein Zielprotein mit einer Ub-Modifikation versehen wird. In dieser Arbeit wird die Stimulation der E2-Enzyme Ubc6 und Ubc7 durch die E3-Enzyme Hrd1 und Doa10 untersucht. Es wird gezeigt, dass Ubc6~Ub-Konjugate bereitwilliger sogenannte "closed conformations" annehmen als Ubc7~Ub-Konjugate, was wiederum die Tendenz, Ub zu übertragen, steigert. Die katalytische Aktivität von Ubc7 kann durch RING-Domänen stimuliert werden. Durch einen allosterischen Mechanismus, der linchpin allostery, werden Ubc7~Ub-Intermediate in "closed conformations" gedrängt. Zusätzlich werden spezifische Kontakte zwischen RING-finger-Domänen und der Ub-Einheit in einem E2~Ub-Konjugat identifiziert. Diese schränken die Flexibilität des Konjugates weiter ein und begünstigen dadurch die Reaktivität des E2~Ub-Intermediates. Dieser Mechanismus scheint weit verbreitet zu sein und wurde schon bei anderen Ub-Ligasen beobachtet. Poly-Ub-Signale werden in mehreren Schritten generiert. In einer Priming genannten Reaktion wird die erste Ub-Einheit auf das Zielprotein übertragen. Dieser Vorgang erfordert sehr flexible Enzyme, die in diversem Umfeld Akzeptorstellen finden und mit Ub modifizieren. Die zweite Reaktion, die elongation, umfasst das schrittweise Anheften weiterer Ub-Moleküle an die erste Einheit. Im Gegensatz zum Priming, beruht die Bildung einheitlicher Ketten auf der wiederholten und robusten Konjugation von Ub-Molekülen in gleichbleibendem Milieu. Ub-Ligasen verwenden verschiedene Strategien, um die unterschiedlichen Herausforderungen dieser Reaktionen zu bewältigen. Während Doa10 je ein E2-Enzym pro Reaktion nutzt, kann Hrd1 ein einzelnes E2-Enzym durch linchpin allostery ausreichend stimulieren, um beide Prozesse durchzuführen, wie diese Arbeit zeigt. === The interaction of RING-finger ubiquitin (Ub) ligases (E3 enzymes) with Ub conjugating enzymes (E2 enzymes) dictates how fast a Ub modification is synthesized on a client protein. This thesis addresses the catalytic stimulation of the E2 enzymes Ubc6 and Ubc7 by their cognate E3 enzymes Hrd1 and Doa10. Results show that Ubc6~Ub conjugates adopt closed conformations more readily than Ubc7~Ub conjugates, indicative for an inherently higher propensity to transfer Ub. The catalytic activity of Ubc7 can be stimulated by a RING domain which relies on so-called linchpin allostery. This drives Ubc7~Ub intermediates into a closed conformation. In addition, specific contacts of the RING-finger domain and the Ub moiety in an E2~Ub conjugate were identified which further restrict the flexibility of the conjugate and thereby increase the reactivity of the E2~Ub intermediate. This seems to represent a common mechanism for the stimulation of E2 enzymes because similar contacts of RING-finger proteins with Ub have been observed for other Ub ligases. Poly-Ub signals on proteins are generated in successive steps. The first reaction, called "priming", comprises the attachment of an initial Ub moiety to the target. This requires high flexibility of the involved enzymes to modify acceptor sites in a versatile environment. The second step is the sequential addition of Ub to previously attached Ub molecules in a process termed elongation. In contrast to priming, the formation of uniform Ub chains relies on the repeated and robust conjugation of Ub moieties in a mostly invariant setting. Ub ligases employ different strategies to meet the divergent requirements of these reactions. Doa10 uses separate E2 enzymes for priming and elongation. This thesis shows that Hrd1 efficiently stimulates a single E2 enzyme for the catalysis of both steps via linchpin allostery.