Entwicklung molekularer Werkzeuge zur Erforschung des Lipidstoffwechsels

• Main Author: Pinkert, Thomas
• Other Authors: Mahrwald, Rainer
• Format: Doctoral Thesis
• Language: German
• Published: Humboldt-Universität zu Berlin 2017
• Subjects: Enzyme; Saure Sphingomyelinas; Phospholipide; Sphingolipide; Sphingomyelin; Ceramid; Fluoreszenz; Förster-Resonanzenergietransfer (FRET); Fluoreszenz-basierte Assays; Murine Embryonale Fibroblasten (MEF); Zweiphotonenfluoreszenzmikroskopie; Enzymes; Acid Sphingomyelinase; Phospholipids; Sphingolipids; Ceramide; Fluorescence; Förster-Resonance Energy Transfer (FRET); Fluorescence-based Assays; Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF); Two-photon Fluorescence Microscopy; 547 Organische Chemie; VK 8707; WD 5050; VG 8757; ddc:547
• Online Access: http://edoc.hu-berlin.de/18452/18698; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-110-18452/18698-5; http://dx.doi.org/10.18452/18034

Im Rahmen dieser Arbeit wurden fluoreszierende Sphingomyelin-Analoga zu Studium der sauren Sphingomyelinase (ASM) synthetisiert. Ausgehend von L-Serin wurde ein Sphingosin-Derivat mit natürlicher Stereochemie dargestellt. Anschließend wurde mittels Phosphorodichloridat-Chemie eine Aminoethylphosphat-Gruppe installiert. Zweifache Fluoreszenzmarkierung ergab Sonden mit der Fähigkeit zu Förster-Resonanzenergietransfer (FRET). Diese wurden als Substrate der ASM akzeptiert und erlaubten die Verfolgung der Enzymaktivität in vitro. Durch die Analyse der photophysikalischen Eigenschaften der Fluorophore wurde das allgemeine Konzept der Phasentrennungs-gestützten Signalverstärkung (PS) abgeleitet. Dieses Konzept wurde erfolgreich bestätigt durch die Synthese einer 30-mal leistungsfähigeren zweiten Generation der FRET-Sonde. Ein homogener Assay wurde entwickelt, der die Quantifizierung der ASM-Aktivität erlaubte. Unter Verwendung von gereinigter rekombinanter humaner ASM, HeLa-Zelllysaten oder Lysaten von murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) als Enzymquelle wurde ausschließlich unter den von der ASM bevorzugten Bedingungen eine vollständige und spezifische Hydrolyse der Sonde beobachtet. Des Weiteren erlaubte die Sonde die Detektion relativer Unterschiede der Aktivität der ASM in kultivierten MEFs mittels Fluoreszenzmikroskopie mit Zweiphotonenanregung (2PE). === Fluorescent sphingomyelin analogues have been synthesized to probe the acid sphingomyelinase (ASM). Starting from L-serine, a sphingosine with natural stereochemistry was synthesized. Subsequently, phosphorodichloridate chemistry was used to install an aminoethyl phosphate moiety. Dual fluorescent labeling afforded probes capable of Förster resonance energy transfer (FRET). They were recognized as substrates of ASM and allowed for monitoring of the enzyme’s activity in vitro. Through analysis of the fluorophores’ photophysical properties, the general concept of partition aided amplification of a FRET probe’s signal (PS) was developed. This concept was successfully confirmed by the synthesis of a second-generation probe with 30-fold improved response. A homogenous assay was developed, which allowed for a quantitation of ASM activity. Using either purified recombinant human ASM, or lysates of HeLa cells or mouse embryonic fibroblasts (MEFs) as an enzyme source, complete and specific cleavage was observed exclusively under conditions preferred by ASM. Furthermore, the probe enabled the detection of relative levels of ASM activity in cultivated MEFs using fluorescence microscopy with two-photon excitation (2PE).