Qualitative und quantitative Analyse der Phosphorylierung von Proteinen der circadianen Uhr

• Main Author: Haaf, Erik
• Other Authors: Linscheid, Michael W.
• Format: Doctoral Thesis
• Language: German
• Published: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I 2012
• Subjects: Massenspektrometrie; circadiane Uhr; Proteomics; Protein Phosphorylierung; Phosphopeptidanreicherung mit TiO2; circadian clock; mass spectrometry; proteomics; protein phosphorylation; phosphopeptide enrichment with TiO2; 540 Chemie; 30 Chemie; ddc:540
• Online Access: http://edoc.hu-berlin.de/18452/17230; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203984; http://dx.doi.org/10.18452/16578

Die Phosphorylierung als posttranslationale Modifikation von Proteinen spielt bei Signalwegen in Zellen eine große Rolle. Für die Entschlüsselung des molekularen Mechanismus der circadianen Uhr ist es daher von Interesse, die Phosphorylierungsstellen beteiligter Proteine zu identifizieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Proteine Period I und II mittels Flüssigkeitschromatographie und Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) auf Phosphorylierungsstellen untersucht. Hierbei lag der Fokus auf der Verbesserung bestehender Methoden, um eine bessere und umfassendere Identifizierung der Phosphorylierungsstellen, insbesondere in Bezug auf mehrfach phosphorylierte Peptide, zu erreichen. Der Arbeitsablauf beinhaltete die Verwendung mehrerer Proteasen, um eine hohe Sequenzabdeckung des Proteins zu erreichen. Nach der Proteolyse wurden die Phosphopeptide mittels Titandioxid angereichert. Hierbei und bei der LC-MS/MS-Analyse wurde Citrat als Additiv verwendet, welches eine bessere Chromatographie multiphosphorylierter Peptide ermöglicht. Bei der MS/MS-Analyse wurden CID und ETD als Fragmentierungsmethoden eingesetzt. Es konnten durch diese Methodik 30 bzw. 42 Phosphorylierungsstellen an den Proteinen Period I und II identifiziert werden, von denen 26 bzw. 14 zuvor nicht beschrieben waren. Nach der qualitativen Identifizierung wurden quantitative Varianten der optimierten Analytik untersucht, um die biologische Funktion der gefundenen Phosphorylierungsstellen untersuchen zu können. Hierbei wurden das metabolische Labeling der Zellen mit 15N-stickstoffhaltigen Aminosäuren und die säurekatalysierte Isotopenmarkierung auf Peptidebene mit 18O-Sauerstoff untersucht. Mit einer optimierten Variante der säurekatalysierten Isotopenmarkierung mit 18O-Sauerstoff lassen sich die Carboxygruppen der Peptide in 5h 30min mit einer Rate von >97% 18O-Sauerstoff markieren. Mit dieser Methode können weitere funktionelle Untersuchungen der Phosphorylierung an den Period-Proteinen durchgeführt werden. === Protein phosphorylation, a posttranslational modification, plays an important role in signal cascades in cells. In order to understand the molecular mechanism of the circadian clock, it is thus of interest to identify the phosphorylation sites on proteins contributing to the system. During the work for this thesis, the proteins Period I and II were analyzed for phosphorylation sites with liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Hereby the focus was on improving existing methods in order to better identify multi-phosphorylated peptides. In the workflow, the Period proteins were digested with several proteases in order to archive a high sequence coverage for analysis. After proteolysis the phosphopeptides were subsequently enriched with titanium dioxide. During phosphopeptide enrichment and reversed phase chromatography, citrate was used as an additive for a better chromatography and recovery of multiphosphorylated peptides. During LC-MS/MS analysis, CID and ETD were used as fragmentation mechanisms in the mass spectrometer. Using these methods, 30 and 42 phosphorylation sites could be identified on the proteins Period I and II, respectively, including 26 and 14 which were previously unpublished. In order to unravel the biological function of these phosphorylation sites, quantitative methods for the optimized LC-MS approach were investigated. This included the metabolic labeling of cells with amino acids containing 15N-nitrogen as well as acid catalyzed 18O-oxygen labeling on peptide level. The developed optimized variant of acid catalyzed 18O-oxygen labeling achieves an inclusion of 18O-oxygen at the peptide carboxy groups with a rate of >97% in 5h 30min. This method can be used for further investigation of the biological function of the phosphorylation on the Period proteins.