Aufbau nanoskopischer Netzwerke aus DNA und Bindeproteinen

• Main Author: Benke, Annegret
• Other Authors: Technische Universität Dresden, Maschinenwesen
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden 2007
• Subjects: DNA; Tet-Repressor-Protein; Molecular Combing; Transfer Printing; DNA-Netzwerk; Stempeln; Adsorption; Rasterkraftmikroskopie; Nanostrukturen; sequenzspezifische Bindung; Gelelektrophorese; Tet-repressor protein; molecular combing; transfer printing; DNA network; stamping; adsorption; scanning force microscopy; nanostructures; sequence specific binding; gel electrophoresis; ddc:660; ddc:570; rvk:WF 9720
• Online Access: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:swb:14-1194889063905-84093; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:swb:14-1194889063905-84093; http://www.qucosa.de/fileadmin/data/qucosa/documents/759/1194889063905-8409.pdf

Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Grundlagenuntersuchungen zum Aufbau von nanoskopischen Netzwerken aus DNA. Dabei werden zwei Wege verfolgt: Das Stempeln von DNA-Molekülen auf ein Substrat und die Herstellung von Verknüpfungen aus DNA mit Hilfe von Bindeproteinen. Stempeln von DNA-Molekülen In dieser Arbeit wurde ein Beitrag zu den materialwissenschaftlichen Grundlagen des Übertragens von DNA mit der Stempel-Technik erbracht. Hierbei wurden sowohl das Beladen des Stempels durch Molecular Combing als auch die Übertragung der Moleküle durch Transfer Printing unter den speziellen Bedingungen der Verwendung von DNA-Molekülen vertieft untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, gestreckte DNA-Moleküle zielgerichtet in eine mikroelektronische Struktur mit Goldkontakten zu übertragen. Dazu wurde ein Verfahren erarbeitet, bei dem die Kontaktstruktur und ein dazu passender, strukturierter PDMS (Polydimethylsiloxan)-Stempel exakt positioniert werden können. Das Adsorptionsverhalten von DNA auf PDMS wurde in Abhängigkeit vom pH-Wert des Puffers untersucht. Im gesamten pH-Bereich von 4 bis 10 wurde Adsorption mit hoher Belegungsdichte und vollständiger Streckung der Moleküle beobachtet. Diese Beobachtung kann im Rahmen eines phänomenologischen Modells erklärt werden, das auf einer Bilanz der Adsorptionskraft und der für die Streckung der DNA notwendigen Kraft beruht. In der Literatur wird hingegen berichtet, dass bisher nur in einem kleinen pH-Bereich um 5,5 diese hohe Adsorptionsrate gestreckter Moleküle auf einer hydrophoben Oberfläche erreicht werden konnte. Das Adsorptionsverhalten von DNA auf PDMS wurde in Abhängigkeit von der NaCl-Molarität des Puffers untersucht. Es wurde festgestellt, dass mit steigender Salzkonzentration die Belegungsdichte an Molekülen zunimmt und bei ca. 100 mM ein Maximum aufweist. Aus dem Gang der Anzahl der adsorbierten Moleküle mit der Salzkonzentration ist erkennbar, dass dieser Prozess zumindest durch zwei konkurrierende Mechanismen bestimmt ist: der Zunahme der Bindungen zwischen DNA und Substrat aufgrund steigender Adsorption von Na+- Ionen auf der DNA bzw. dem Substrat und von Cl-- Ionen auf dem Substrat (dies führt zu einer Zunahme der Adsorptionsrate) und der Stabilisierung des Doppelstranges (dies führt zu einer Abnahme der Adsorptionsrate). Die hohe Adsorptionsrate geschlossener Plasmide zeigte, dass die Adsorption auf PDMS auch bei DNA-Molekülen möglich ist, die keinen bevorzugten Ort für das Aufschmelzen des Doppelstranges haben. Experimentell konnten die Ergebnisse einer Modellrechnung bestätigt werden, wonach bei doppelsträngiger DNA bereits zwei aufgeschmolzene Basenpaare ausreichen, damit die Adsorption über hydrophobe Wechselwirkungen beginnen kann. Der Nachweis der vollständigen Übertragung der DNA-Moleküle während des Transfers vom Stempel auf das Substrat wurde rasterkraftmikroskopisch geführt. Der Transferprozess wurde experimentell untersucht und daraus resultierend seine Darstellung als zweistufiger Mechanismus vorgeschlagen. Es wurde gezeigt, dass Wassermolekülen beim Übertragungsprozess die entscheidende Rolle zukommt: Wassermoleküle, die sich entlang der DNA befinden, müssen den Kontakt zum Wasserlayer auf dem Glas vermitteln, so dass die DNA nach dem Prinzip des kapillaren Greifens übertragen werden kann. DNA-Verknüpfungen mittels Tet-Repressor-Protein Die aus der bakteriellen Genregulation bekannte sequenzspezifische Bindung zwischen der tetO-Sequenz auf der DNA und dem TetR-Protein wurde genutzt, um definierte Konstrukte aus DNA und Bindeproteinen herzustellen. Mit dem modifizierten Protein scTetRtDL, das zwei Bindedomänen für tetO besitzt, konnten jeweils zwei DNA-Moleküle verknüpft werden. Aus 568 bp-Fragmenten, die leicht außermittig die tetO-Sequenz tragen, wurden durch die Bindung mit scTetRtDL kreuzförmige DNA-Strukturen hergestellt. Das ca. 1 µm lange, linearisierte und tetO-tragende Plasmid pUC19/AV16 wurde verwendet, um größere Strukturen herzustellen. Durch Schneiden des Plasmides mit verschiedenen Restriktionsenzymen und der daraus resultierenden Variation der Position von tetO ist die Konstruktion von unterschiedlichen Strukturen möglich. Mittels Proteinbindung wurden Kreuzungen und aneinander gekettete Moleküle (so genannte Verlängerungen) erzeugt. Die konstruierten DNA-Protein-Komplexe wurden mit dem Rasterkraftmikroskop abgebildet. Mittels Gelelektrophorese wurde der Einfluss der sequenzinduzierten Biegungen im Plasmid pUC19/AV16 auf das Laufverhalten im Gel untersucht.