Entwicklung und Implementierung einer internen Kontrolle für die PCR-Diagnostik humanpathogener DNA-Viren

• Main Author: Stein, Kathrin
• Other Authors: Universität Leipzig, Institut für Virologie
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: Universitätsbibliothek Leipzig 2014
• Subjects: Interne Kontrolle; DNA-Viren; internal controll; DNA-virus; ddc:610
• Online Access: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:15-qucosa-133486; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:15-qucosa-133486; http://www.qucosa.de/fileadmin/data/qucosa/documents/13348/Online%20Version2.pdf

Ziel der Arbeit war die Entwicklung und Implementierung einer internen Extraktions-Kontrolle für die quantitative Echtzeit-PCR humanpathogener DNA-haltiger Viren der Routinediagnostik des Instituts für Virologie der Universität Leipzig, basierend auf einem artfremden Vollvirus. Durch Verwendung einer internen Kontrolle sollen falsch-negative PCR-Ergebnisse aufgrund unzureichender DNA-Extraktion aus humanem Probenmaterial identifiziert werden. Die interne Kontrolle soll zur Zeitersparnis als Multiplex-PCR durchgeführt werden. Verwendet wurde das Baculoviurs Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, da keine Baculovirus-Infektionen beim Menschen vorkommen. Es wurden Primer und Sonden so entwickelt, dass sowohl das Amplifikat als auch Primer und Sonden eine hohe Übereinstimmung zu den Amplifikaten, Primern und Sonden der humanpathogenen Viren zeigen. Dadurch soll die PCR-Effizienz der internen Kontrolle möglichst ähnlich zu der PCR-Effizienz der humanpathogenen Viren sein. In Vorversuchen wurde gezeigt, dass eine Hybridisierung der Baculovirus-Primern und -Sonden an das Genom humanpathogener Viren und das humane Genom minimal war. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass sich die Baculovirus-DNA als interne Kontrolle vemischt mit Lysispuffer über mindestens eine Woche bei 4°C ohne signifikante Verluste lagern lässt. Im vorgestellten und validierten Protokoll wird die interne Kontrolle automatisch während der maschinellen DNA-Extraktion zu jeder Probe hinzugegeben. An bereits positiv getesteten Patientenproben konnte gezeigt werden, dass Konzentrationen von 10-20 Kopien Baculovirus pro Ansatz sicher nachweisbar sind und gleichzeitig auch geringe DNA-Mengen an humanpathogener Viren sicher nachgewiesen werden.