Untersuchungen zur Apoptoseinduktion des Virus der Infektiösen Bursitis (IBDV)

• Main Author: Lüken, Caroline
• Other Authors: Universität Leipzig, Veterinärmedizinische Fakultät
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: Universitätsbibliothek Leipzig 2009
• Subjects: Tiermedizin; ddc:610
• Online Access: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:15-20090224-072016-6; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:15-20090224-072016-6; http://www.qucosa.de/fileadmin/data/qucosa/documents/3553/Untersuchungen_zur_Apoptoseinduktion_des_Virus_der_Infekti%C3%B6sen_Bursitis_%28IBDV%29.pdf

Das Virus der infektiösen Bursitis (IBDV) gehört dem Genus Avibirnavirus der Familie Birnaviridae an. Die infektiöse Bursitis ist eine bedeutende, weltweit verbreitete Erkrankung des Geflügels. IBDV beinhaltet zwei verschiedene Serotypen: Serotyp 1 und 2. Serotyp 2 ist apathogen und wurde aus dem Respirationstrakt von Puten isoliert. Serotyp 1 ist pathogen für Hühner. Innerhalb des Serotyp 1 unterscheidet man klassisch virulente (cv), hochvirulente (hv) Stämme und Variantstämme. Während cv- und hv-Stämme zu nekrotisch-hämorrhagischen Entzündungen der Bursa Fabricii führen, verursachen Variantstämme eine sehr rasche Atrophie dieses Organs. Daher liegt die Annahme nahe, dass die Variantstämme ein besonders hohes Potenzial zur Apoptoseinduktion besitzen. Diese Hypothese war grundlegend für die Fragestellungen und Zielsetzungen dieser Arbeit. Zur Generierung infektiöser Viren mittels reverser Genetik wurden im Zuge dieser Arbeit zunächst „Volle-Länge-Plasmide“ beider Segmente des Variantstamms Variant E hergestellt. Vor das 5`-Ende der IBDV-spezifischen Sequenz wurde ein T7-Promotor kloniert, am 3`-Ende besitzt das „Volle- Länge-Plasmid“ eine Restriktionsenzymschnittstelle zur Linearisierung. Mittels „QuikChange“-PCR wurden die für die Zellkulturadaptation benötigten Punktmutationen in die VP2-codierende Region des Segments A eingefügt. Nach der Sequenzierung wurden, ebenfalls mittels „QuikChange“-PCR, unerwünschte Mutationen in beiden Segmenten revertiert. Mittels in vitro-Transkription wurde die cDNA der „Volle-Länge-Plasmide“ von Segment A und B des Variant E-Stamms und Segment B des klassisch virulenten Stammes Cu-1 in cRNA umgeschrieben. Durch Cotransfektion verschiedener Kombinationen von cRNA in HEF wurde ein zellkulturadaptiertes reassortantes Virus, bestehend aus Segment A von Variant E und Segment B von Cu-1 generiert. Dieses wurde als Var E A/Cu-1 B bezeichnet. Nach drei aufeinander folgenden Passagen in HEF wurden die infektiösen Nachkommen geerntet und durch RT-PCR, Sequenzierung, Restriktionsenzymanalyse (REA), indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT) und Western blot charakterisiert. Durch Elektronenmikroskopie wurden die typischen morphologischen Merkmale von IBDV nachgewiesen. Durch Ermittlung einer Wachstumskinetik zeigte sich, dass das Virus im Vergleich zu zellkulturadaptiertem Cu-1 eine langsamere Vermehrung aufwies, jedoch einen annähernd gleichen Virustiter erreichte. Zum Nachweis von Apoptose wurden infizierte HEF zu definierten Zeitpunkten geerntet und im DNA-Laddering-Versuch und im Caspase-Glo 3/7 Assay untersucht. Dabei wurde die an HEF adaptierte Reassortante Var E A/Cu-1 B mit dem klassisch virulenten Stamm Cu-1 hinsichtlich des Potenzials zur Apoptoseinduktion verglichen. Die Anwesenheit der viralen Polymerase VP1 von Cu-1 in beiden Viren ließ einen direkten Vergleich der von dem Segment A codierten, für die Apoptose verantwortlichen Proteine VP2 und VP5 beider Stämme zu. Durch diese Experimente wurde deutlich, dass die Reassortante Var E A/Cu-1 B im Vergleich zu Cu-1 eine schwächere Fähigkeit zur Apoptoseinduktion zeigt. Dieses unerwartete Ergebnis kann mit der Verwendung zellkulturadaptierter Viren mit reduzierter Virulenz, einer geringeren Replikationsgeschwindigkeit der Reassortanten und/oder der Verwendung eines nichtwirtszellspezifischen Zellkultursystems zu begründen sein. Weiterführende Untersuchungen in vivo, unter Einbeziehung des Elternstamms Variant E, wären daher von Interesse. VP5 wurde von mehreren Arbeitsgruppen als ein apoptoseauslösendes Protein identifiziert. Andere Studien ergaben jedoch auch, dass VP5 in frühen Stadien der Infektion Apoptose inhibiert. Vergleiche einer in dieser Arbeit generierten VP5-Deletionsmutante mit Cu-1 sollten daher klären, wie sich eine VP5-Deletion bei einem gut untersuchten, zellkulturadaptierten, klassisch virulenten Stamm auf die Induktion von Apoptose auswirkt. Die Cu-1 VP5-Deletionsmutante zeigte, trotz verminderter Replikationsgeschwindigkeit, in den Anfangsstadien der Infektion ein erhöhtes apoptotisches Potenzial. Daraus lässt sich schließen, dass VP5 eine inhibierende Wirkung auf die Apoptose besitzt. Möglicherweise liegt der biologische Grund darin, dass sich IBDV in den Anfangsstadien der Infektion durch die VP5-inhibierte Apoptose besser vermehren kann.