Einflüsse der Aminosäuresequenz und erregerspezifischer Eigenschaften auf die Konvertierbarkeit chimärer Prion-Proteine in vitro

• Main Author: Kupfer, Leila
• Other Authors: Universität Leipzig,
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: Universitätsbibliothek Leipzig 2007
• Subjects: Tiermedizin; zellfreie Konversion; chimäres Prion-Protein; Aminosäuresequenz; stammspezifische Eigenschaften; ddc:610
• Online Access: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:15-20071219-075151-2; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:15-20071219-075151-2; http://www.qucosa.de/fileadmin/data/qucosa/documents/3511/Einfl%C3%BCsse_der_Aminos%C3%A4uresequenz_und_erregerspezifischer_Eigenschaften_auf_die_Konvertierbarkeit_chim%C3%A4rer_Prion-Proteine_in_vitro.pdf

Leila Kupfer Einflüsse der Aminosäuresequenz und erregerspezifischer Eigenschaften auf die Konvertierbarkeit chimärer Prion-Proteine in vitro Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig und Institut für Neue und Neuartige Tierseuchenerreger des Friedrich-Loeffler-Institutes, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Insel Riems Eingereicht im Februar 2007 127 Seiten, 40 Abbildungen, 4 Tabellen, 230 Literaturangaben, 13 Seiten Anhang Schlüsselwörter: zellfreie Konversion, chimäres Prion-Protein, Aminosäuresequenz, stammspezifische Eigenschaften Die genauen molekularen Mechanismen bei der Entstehung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) sind immer noch nicht eindeutig geklärt. Es wird vermutet, dass das auslösende Ereignis, die irreversible Umfaltung oder Konversion eines körpereigenen Membranproteins, des zellulären Prion-Proteins PrPC in seine krankheitsassoziierte, Proteinase K (PK) resistente Isoform PrPSc, eine ‚autokatalytische’ Konversionsreaktion initiiert. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass dabei die Aminosäuresequenzen des PrPC und PrPSc die Effizienz dieser Konversionsreaktion sowohl bei Übertragungen innerhalb derselben Spezies als auch über Speziesgrenzen hinweg beeinflussen. Am Friedrich-Loeffler-Institut wurden in vergangenen Arbeiten zwei transgene Inzucht-Mauslinien etabliert, die auf der Basis von amino- und carboxyterminalen murinen Anteilen ein chimäres PrPC mit zentralen ovinen (Tgmushp XIX) oder bovinen (Tgmubo XIII) Sequenzen exprimieren. Erstaunlicherweise erwiesen sich die Tgmubo XIII-Mäuse als nahezu resistent gegen verschiedene TSE-Erreger aus Schaf, Rind und Maus, während die Tiere der Linie Tgmushp XIX ausgesprochen gut infizierbar waren. Da sich die PrP-Sequenz dieser beiden Mauslinien um lediglich vier Aminosäurereste unterscheidet, war es Ziel dieser Studie zu ermitteln, welcher Aminosäure-Austausch die verminderte Infizierbarkeit der Tgmubo XIII bedingt. Um kostenspielige und zeitaufwenige Tierversuche zu vermeiden, wurde hierzu ein zellfreier Konversionsansatz gewählt. Dieser birgt den Vorteil, dass die molekularen Einflüsse auf die Konversion in einem stark vereinfachten System innerhalb weniger Tage festgestellt werden können. Insgesamt wurden 19 verschiedene PrPC-Mutanten kloniert, in E. coli rekombinant exprimiert, affinitätschromatographisch aufgereinigt und im zellfreien Konversionsassay mit Zusammenfassung 85 ebenfalls hochaufgereinigtem PrPSc aus Gehirnextrakten final BSE- oder Scrapie-infizierter (drei unterschiedliche Erregerstämme: Me7, 22A, 87V) Mäuse für bis zu drei Tage inkubiert. Die stattgefundene Konversion der Mutanten wurde anschließend mittels PK-Verdau festgestellt. Die im Tierversuch ermittelten Ergebnisse für Tgmubo XIII und Tgmushp XIX konnten so in vitro für PrP-mubo und PrP-mushp bestätigt werden, d.h. nur letzteres wurde in ein PK-resistentes PrPres-Fragment konvertiert. Ausgehend von PrP-mushp wurden die vier unterschiedlichen Positionen gegen die jeweils entsprechende Aminosäure aus PrP-mubo mutiert. Dabei zeigte der Austausch von Asparagin gegen Serin auf Position 142 der chimären Sequenz den stärksten Effekt: PrP-mushpN142S ließ sich nur durch Koinkubation mit BSE-, aber nicht mehr durch Scrapie-PrPSc konvertieren. Substitutionen durch Alanin oder Glutamin führten zu einer weiteren Minderung der Konversionsrate. Auch beim Austausch mehrerer Aminosäuren in Kombination mit Serin an Position 142 wurde der hemmende Effekt dieser Substitution deutlich. Einen ähnlichen, wenn auch nicht ganz so starken Einfluss hatten Aminosäureaustausche auf Position 185. Wurde dort anstelle von Glutamin Glutamat eingefügt, konnte das so entstandene Konstrukt PrP-mushpQ185E nicht mehr durch Me7 aber noch durch 22A, 87V und BSE konvertiert werden. Wurde Glutamin durch Alanin oder Asparagin ersetzt, verminderte sich die Konversionsrate für 22A, 87V und BSE. Diese Effekte traten nur bei chimärem PrPC auf. Der singuläre Austausch der entsprechenden Aminosäuren 146 und 189 der ovinen Sequenz gegen die des bovinen PrPC zeigten keine derartige Hemmung der Konvertierbarkeit. Genauso wenig hatte die Deletion des Aminoterminus der chimären Prion-Proteine einen hemmenden Effekt. Lediglich nach Inkubation mit mauspassagierter BSE stellte sich das PrPres-Fragment des PrP-mushpΔ94 als Doppelbande im Immunoblot dar, deren Bedeutung jedoch unbekannt ist. Durch den zellfreien Konversionsassay konnten die im Tierversuch ermittelten Ergebnisse bezüglich der Empfänglichkeit der transgenen, chimäres Prion-Protein exprimierenden Mauslinien bestätigt werden. Die Erkenntnis, dass zwei Aminosäuren der chimären Sequenz für die Inkonvertibilität verantwortlich sind, zeigt, dass ein direkter Zusammenhang zwischen der Primärstruktur des Prion-Proteins und dessen Überführbarkeit in seine pathologische Isoform besteht. Zusätzlich konnten stammspezifische Effekte auf die zellfreie Konversion ermittelt werden, die zum einen ebenfalls von der Aminosäuresequenz des rekombinanten PrPC, zum anderen aber auch von den Eigenschaften des jeweiligen eingesetzten Stammes abhängen. Die in der vorgestellten Arbeit ermittelten Ergebnisse untermauern die Prionhypothese, wonach einzelne Aminosäuren des Prion-Proteins die Erregervermehrung maßgeblich beeinflussen können. Allerdings werfen die beobachteten stammspezifischen Effekte auch bisher ungelöste Fragen zu den dabei zugrunde liegenden Mechanismen auf