In Vitro and In Vivo Applications of Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy

• Main Author: Staroske, Wolfgang
• Other Authors: Technische Universität Dresden, Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften
• Format: Doctoral Thesis
• Language: English
• Published: Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden 2010
• Subjects: Mikropumpe; Strömungsbild; Zwei-Focus-FCCS; RNA Interferenz; siRNA; chemische Modifikationen; Zwei-Farben-Kreuzkorrelations-Spektroskopie; Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie; micro-pump; flow profile; two-focus-FCCS; RNA Interference; fluorescence cross-correlation spectroscopy; fluorescence correlation spectroscopy; ddc:530; rvk:VG 8750
• Online Access: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-62329; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-62329; http://www.qucosa.de/fileadmin/data/qucosa/documents/6232/Dissertation%20Wolfgang%20Staroske%20Final.pdf

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) analyzes the fluctuations in the fluorescence intensity, which is emitted from a tiny excition volume, to obtain information about the concentration, the mobility, and the molecular interactions of labeled molecules. The more advanced fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) increases the precision in the determination of fl ow velocities and binding constants compared to standard FCS. The miniaturization in biomedical and chemical engineering has been developing rapidly, propelled by the vision of a fully functional laboratory on a single chip and its use in human therapeutics, for example, as implanted drug delivery system. A key requirement to fulfill this vision is the ability to handle small fl uid volumes. Handling liquids using the electrohydrodynamical principle circumvents many of the disadvantages of other systems. The complex flow pattern in the active region of such a pump could not be resolved by common tracking techniques. In this thesis, two-focus FCCS (2f-FCCS) was used to map the flow pro file inside a micropump. The high precision of 2f-FCCS in the determination of fl ow measurements even with small fluorescent particles allowed the measurement of the flow velocities induced by electrohydrodynamic forces acting on the solvent, while excluding the effects of dielectrophoretic forces acting on larger particles. Analysis of the fl ow data indicates a fl ow pattern that consists of two vortices of different size and opposite direction of rotation. The flow pattern derived by 2f-FCCS explains the observed complex particle trajectories in the force field and the accumulation of particles in well-de fined regions above the microelectrode array. In the second part of this thesis, the mechanism of RNA interference (RNAi) was studied by dual-color FCCS in vivo. RNAi is an evolutionary conserved gene silencing mechanism, which uses short double-stranded RNA molecules, called short interfering RNAs (siRNAs), as effector molecules. Due to its speci city and simplicity, RNAi yields a great potential for a widespread therapeutic use. To broaden the therapeutic applications, the in vivo stability of siRNAs has to be improved by chemical modi cations, but some of these modi fications inhibit the gene silencing mechanism. The presented FCCS assays are very well suited to investigate the individual assembly steps of RNAi machinery with very high specifi city and sensitivity in real time and to study the cleavage activity of the activated RNAi machinery. A direct correlation between activity of the RNAi machinery and the results from the FCCS measurements could be shown. The in fluence of several chemical modi cations on the assembly and activity of the RNAi machinery was investigated with these assays. === Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) analysiert die Fluktuationen im Fluoreszenzsignal eines kleinen angeregten Volumens, um Informationen über die Konzentration, die Bewegung und die Interaktionen der markierten Moleküle zu erhalten. Die Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie (FCCS) erhöht die Genauigkeit bei der Messung von Fließgeschwindigkeiten und Bindungskonstanten im Vergleich zur Standard-FCS. Die Miniaturisierung der Biomedizin und Chemie hat sich rapide entwickelt, angetrieben von der Vision eines kompletten Labors auf einem Chip und dem Einsatz dieses in der medizinischen Therapie, zum Beispiel als implantierter Medikamentenspender. Ein Schlüsselelement zur Erfüllung dieser Vision ist der Transport von kleinsten Flüssigkeitsmengen in diesen miniaturisierten Systemen. Der Transport von Flüssigkeiten mittels des elektrohydrodynamischen Prinzips umgeht viele Nachteile von anderen Systemen, allerdings zeigt eine solche Pumpe ein kompliziertes Strömungsbild in der aktiven Region, welches sich mit herkömmlichen Methoden wie Teilchenverfolgung nicht vermessen ließ. Hier wurde Zwei-Fokus-FCCS (2f-FCCS) genutzt, um das Strömungsbild in der Pumpe zu vermessen. Die hohe Genauigkeit der 2f-FCCS bei der Bestimmung von Fließgeschwindigkeiten auch mit kleinen fluoreszierenden Teilchen ermöglichte die Messung der Fließgeschwindigkeiten, aufgrund der auf das Lösungsmittel wirkenden elektrohydrodynamischen Kräfte, unter Ausschluss der auf größere Teilchen wirkenden dielektrophoretischen Kräfte. Die Analyse der Daten ergab, dass das Strömungsbild aus zwei entgegengesetzt rotierenden unterschiedlich großen Wirbeln besteht. Dieses Strömungsbild erklärt die komplizierten Teilchenbewegungsbahnen und die Anreicherung der Teilchen in klar abgegrenzten Bereichen über den Mikroelektroden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der RNAi-Mechanismus in lebenden Zellen mittels Zwei-Farben-FCCS untersucht. RNA Interferenz (RNAi) ist ein evolutionär erhaltener Geninaktivierungsmechanismus, der kurze doppelsträngige RNA Moleküle, so genannte kurze interferierende RNAs (siRNAs), als Effektormoleküle nutzt. Die Spezifi tät und Einfachheit der RNAi hat ihr ein weites Feld in der medikamentösen Therapie geöffnet. Zur Erweiterung dieses Feldes ist es nötig die Stabilität der siRNAs im Körper mittels chemischer Modi fikationen zu erhöhen. Einige dieser Modifikationen hemmen aber den RNAi-Mechanismus. Die hier vorgestellten FCCS Experimente sind sehr gut geeignet, um die einzelnen Schritte des Zusammenbaus der RNAi Maschinerie mit hoher Empfi ndlichkeit und Spezi fität in Echtzeit zu untersuchen und die Aktivität der RNAi Maschinerie zu studieren. Es konnte ein Zusammenhang zwischen der Aktivität der RNAi Maschinerie und den Ergebnissen der FCCS Messungen hergestellt werden. Der Einfluss von verschiedenen chemischen Modikationen auf den Zusammenbau und die Aktivität der RNAi Maschinerie wurde mit diesen neuartigen Methoden untersucht.