Untersuchungen zur Dynamik und zum Aggregationsmechanismus von alpha-Synuklein in chronischen Toxinmodellen der dopaminergen Primärzellkultur

• Main Author: Oster, Sandra
• Other Authors: Technische Universität Dresden, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden 2018
• Subjects: alpha-Synuklein; Rotenon; Paraquat; dopaminerge Primärzellkultur; Parkinson; Aggregation; alpha-synuclein; rotenone; paraquat; dopaminergic primary cell culture; Parkinson's disease; aggregation; ddc:610; rvk:XG 8804
• Online Access: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-232129; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-232129; http://www.qucosa.de/fileadmin/data/qucosa/documents/23212/Dissertation_Sandra_Oster_Qucosa_pdfa.pdf

Ein Schlüsselbefund der Parkinson-Krankheit auf zellulärer Ebene ist das Auftreten von Protein-Einschlusskörperchen, sogenannten Lewykörperchen. Der Hauptbestandteil dieser Lewykörperchen ist pathologisch aggregiertes, fibrilläres α-Synuklein, ein Protein, welches Einfluss auf präsynaptische Vesikel, Protein- und Enzymfunktionen sowie den Dopaminstoffwechsel und den axonalen Transport hat. Bis heute ungeklärt ist die Ursache der Aggregation des Proteins. Zahlreiche Forschungsaktivitäten werden in diese Richtung unternommen. Die pathologischen Mechanismen, die zur abnormen Aggregation von α-Synuklein führen, bleiben noch weitgehend unbekannt. Ein großer Teil der Literatur unterstützt die Hypothese, dass α-Synuklein bei Punktmutationen oder erhöhter Expression anfällig für Aggregationen ist und damit Neuronen geschädigt werden. Die Einzelheiten dieses sukzessiven Aggregationsprozesses und die Mechanismen, die dabei letztlich den Zelltod verursachen, bleiben unklar. Alterungsprozesse und Umweltfaktoren sind entscheidende Risikofaktoren. Obwohl es immer mehr Hinweise gibt, dass α-Synuklein-Aggregate eine wichtige pathophysiologische Rolle spielen, wird bisher noch unzulänglich verstanden, wie die für die dopaminergen Neurone toxische Wirkung entfaltet wird. Als gesicherter Pathomechanismus der Degeneration der dopaminergen Nervenzellen gilt ein erhöhter oxidativer Stress. Es wird vermutet, dass er zur Aggregation des α-Synukleins beitragen kann. Ziel dieser vorgelegten Arbeit ist es, durch die Verwendung eines geeigneten Zellkulturmodells zur Aufklärung der beschriebenen pathologischen Mechanismen beizutragen. In dieser Studie wurden zwei artifizielle Modellsubstanzen in einer dopaminergen Primärzellkultur eingesetzt, die Pestizide Rotenon und Paraquat, um die pathologischen Verhältnisse in der Substantia nigra zu simulieren. Sie erzeugen oxidativen Stress durch Hemmung der mitochondrialen Atmungskette bzw. Redoxreaktionen mit molekularem Sauerstoff, was zum dopaminergen Zelltod führt. Im Rahmen dieser Studie gelang es, beide Parkinson-Zellkulturmodelle anhand der Lokalisierung, des Aggregationsverhaltens, des Einflusses auf die Mikroglia-Aktivierung sowie des Abbaus von α-Synuklein näher zu charakterisieren. Hierzu wurde α-Synuklein durch Fluoreszenzfärbung, Westernblot und Immunpräzipitation analysiert. Eine kurzzeitige Behandlung mit hoch konzentrierten Toxinen löst eine akute Degeneration dopaminerger Neurone aus, die so nicht der des Idiopathischen Parkinsons entspricht. Beim IPS erfolgt die Degeneration über Jahre hinweg. Um auch den Einfluss der zellulären Alterung auf die α-Synuklein-Aggregation zu zeigen, wurden die in dieser Arbeit verwendeten Zellkulturen über 46 Tage kultiviert und die Pestizid-Konzentration so eingestellt, dass etwa 25-50 % der dopaminergen Neurone absterben. Es konnte gezeigt werden, dass es nach chronischer Behandlung mit dem jeweiligen Pestizid zu den verschiedenen Zeitpunkten Unterschiede in der Lokalisation sowie in der Konformation von α-Synuklein gibt. Die zum Vergleich nur bis zum Tag 11 kultivierten Zellkulturen zeigten nach kurzer Behandlung mit hochkonzentrierter Toxin-Menge eine Ansammlung von α-Synuklein im Soma, aber keine Auswanderung und Lokalisierung in und an den Neuriten, wie es nach chronischer Rotenon-Behandlung beobachtet werden konnte. Bei den Rotenon-behandelten Zellen ist ein Prozess der Verlagerung und Anhäufung des α-Synuklein aus dem Soma in die Neuriten bereits ab einem früheren Zeitpunkt zu beobachten als in den Kontrollen, welche sich aber mit zunehmendem Alter ähnlich verhalten. Außerdem konnte in den Kulturen, besonders bei den Rotenon-behandelten dopaminergen Neuronen, ein punktförmiges Verteilungsmuster und größere Ansammlungen des Proteins in den Neuriten beobachtet werden, was für eine aggregierte Form des α-Synukleins spricht. Diese Aggregate ließen sich durch die Proteo-Aggreosom-Färbung nachweisen. Auch der Nachweis von am Serin 129 phosphoryliertem α-Synuklein in diesen größeren Ansammlungen gilt als Zeichen für eine aggregierte Form. Die Beobachtung, dass α-Synuklein mit zunehmendem Kulturalter aus dem Soma in die Peripherie austritt, konnte bei der chronischen Paraquat-Behandlung so nicht getätigt werden. Unter Paraquat-Behandlung war keine Herauf-Regulierung der Gesamt-α-Synuklein Expression in der Kultur zu beobachten, wie dies sowohl bei Kontrolle als auch bei Rotenon der Fall ist. Wir vermuten im Paraquat-Modell, dass die sich im Soma ansammelnde Form von α-Synuklein durch vermehrte Einschleusung in den Zellkern zur Toxizität beitragen kann. Auch eine Interaktion von α-Synuklein mit der Zellmembran könnte unter Paraquat-Einfluss zum dopaminergen Zelltod beitragen. Durch Immunpräzipitation und Fluoreszenz-Doppelfärbung von α-Synuklein und Ubiquitin konnten wir den Abbau des fehlgefalteten α-Synukleins in der Zelle durch Ubiquitinierung nachweisen. Unter Rotenon ist ab DIV 14 eine starke Kolokalisation von α-Synuklein und Ubiquitin zu erkennen, die im Verlauf der Kultur nachlässt und nur noch in punktförmigen Aggregaten außerhalb der Zelle zu sehen ist. Unter Paraquat zeigte sich während der gesamten Kultivierung Polyubiquitinierung und Kolokalisation der beiden Proteine in der gesamten Zelle. Die Aggregationsform von α-Synuklein scheint das Proteinabbausystem durch Ubiquitinierung zu beeinflussen, da wir davon ausgehen, dass es sich bei der α-Synuklein-Konformation zu verschiedenen Zeitpunkten in den Paraquat-behandelten dopaminergen Neuronen nicht um die Aggregationsform handelt, die wir unter Rotenon beobachten konnten.