Développement et évaluation d'une méthode fondée sur la PCR temps réel pour la caractérisation des bioaérosols : application au groupe des actinomycètes

• Main Author: Betelli, Laetitia
• Language: FRE
• Published: Université de Bourgogne 2013
• Subjects: [SDV:SA] Life Sciences/Agricultural sciences; [SDV:SA] Sciences du Vivant/Sciences agricoles; [SDV:AEN] Life Sciences/Food and Nutrition; [SDV:AEN] Sciences du Vivant/Alimentation et Nutrition; Bioaérosol; Actinomycète; PCR temps réel; Compostage; Prélèvement; Méthode analytique; Exposition professionnelle
• Online Access: http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00935647; http://tel.archives-ouvertes.fr/docs/00/93/56/47/PDF/these_A_BETELLI_Laetitia_2013.pdf

Les actinomycètes sont des bactéries ubiquitaires et certains sont reconnus comme potentiellement pathogènes pour l'Homme, dans l'air de certains lieux de travail. C'est notamment le cas dans l'air des plates-formes de compostage où les concentrations peuvent atteindre des valeurs relativement élevées. L'exposition des salariés à ce type de bioaérosols peut être la cause de pathologies diverses (notamment des pneumopathies d'hypersensibilité). Bien que le problème soit reconnu, la bibliographie démontre un manque de connaissances à propos de l'évaluation du risque : aucune méthode globale de prélèvement et d'analyse n'est, à l'heure actuelle, standardisée pour l'étude de ces bioaérosols, si bien qu'il n'existe aucune relation dose-effets pour la plupart de ces agents ni même de valeur limite d'exposition professionnelle. Les méthodes traditionnellement utilisées ne sont pas sans inconvénient (sous-estimation de la concentration réelle notamment) et le plus souvent non-spécificiques. C'est pourquoi l'objectif de la thèse, ici décrite, est le développement et l'évaluation de la technique de biologie moléculaire qu'est la PCR temps réel pour la quantification de bactéries dans ces bioaérosols. La méthode a tout d'abord été développée et optimisée notamment par le dessin d'oligonucléotides, par la comparaison de protocoles d'extraction d'ADN et par la réalisation de gammes étalons. Elle a ensuite été comparée aux techniques plus traditionnelles, encore largement utilisées, que sont le dénombrement du bacteries cultivable par mise en culture et l'épifluorescence, à la fois sur des cultures de cellules et sur des bioaérosols expérimentaux. Ce n'est qu'après l'avoir caractérisé qu'elle a été appliquée sur des bioaérosols prélevés en conditions réelles d'exposition, sur des plates-formes de compostage.La méthode développée, basée sur une extraction d'ADN et une PCR temps réel, permet la quantification de l'ADN de Thermoactinomyces vulgaris (basée sur l'amplification du gène GyrB), de Thermobifida fusca et T. alba (gène ecf) et des streptomycètes mésophiles (ARNr 23S). La PCR permet l'obtention de résultats fortement corrélés à ceux issus du dénombrement sur milieux gélosés mais offre de réels avantages par rapport à la culture. Comme ces quantifications prennent en compte n'importe quelle forme de la bactérie (cellules végétatives et spores), la PCR dépasse les inconvénients de sous-estimation liés aux méthodes traditionnelles. La technique a un réel avantage de spécificité, elle est répétable et sensible. Les campagnes de prélèvements effectuées sur 5 plates-formes de compostage en France ont permis de mesurer les concentrations en bactéries mésophiles et thermophiles par culture et d'établir celles en Thermoactinomyces vulgaris, Thermobifida sp. et Streptomyces sp. par PCR. L'étude confirme que les activités de compostage sont génératrices de bioaérosols avec parfois des valeurs relativement élevées selon les points échantillonnés. Elle met également en exergue des informations comme la distribution granulométrique du bioaérosol ou l'adéquation entre le type de prélèvement effectué et l'analyse par PCR. Les travaux menés, du développement de la méthode qPCR appliquée au groupe des actinomycètes à son application sur des échantillons environnementaux, apportent de nombreuses données pour la quantification des actinomycètes aéroportés. Ils ont permis d'acquérir des éléments de validation concernant la méthode mise en place et ont livré les seules mesures de concentrations disponibles à l'heure actuelle, pour T. vulgaris, Thermobifida sp., et les streptomycètes mésophiles dans l'air des plates-formes de compostage