Développement de méthodes d'analyse de l'ADN par clivage d'une chimère ARN/ADN et par spectrométrie de masse MALDI-TOF

• Main Author: Mauger, Florence
• Language: FRE
• Published: Université Pierre et Marie Curie - Paris VI 2012
• Subjects: [SDV:GEN] Life Sciences/Genetics; ADN; Séquence; Méthode; Chimère ARN/ADN; Clivage; MALDI-TOF MS
• Online Access: http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00833267; http://tel.archives-ouvertes.fr/docs/00/83/32/67/PDF/rapport.pdf

Depuis le séquençage complet du génome humain, la génomique se focalise sur la détection des modifications de l'ADN des gènes potentiellement impliqués dans les maladies humaines. Les modifications de l'ADN sont au niveau de la séquence ou épigénétique. Ces polymorphismes, fréquents, rares, connus ou inconnus, peuvent être identifiés par le développement de nouvelles méthodes de séquençage de l'ADN pour chaque individu. Ce projet a pour but le développement de méthodes d'analyse de l'ADN par clivage d'une chimère ARN/ADN et par MALDI-TOF MS. Elle repose sur l'utilisation d'une nouvelle classe d'ADN polymérases qui peut incorporer également des ribonucléotides. La chimère ARN/ADN, simple ou double brin, contient trois bases désoxynucléotides et une quatrième base sous sa forme ribonucléotide. Elle est ensuite clivée après chaque ribonucléotide par l'hydroxyde de sodium. Les fragments de clivage se terminent par un ribonucléotide qui possède un groupement 3'- phosphate terminal. Ils sont dessalés par des billes échangeuses de cation et leurs masses sont analysées par MALDI-TOF MS. La comparaison des masses de l'individu avec celles de la séquence de référence est significative d'un changement dans la séquence d'ADN. Les fragmentations en phase gazeuse de la chimère d'ARN/ADN ont également été étudiées. Cette méthode est adaptée pour l'étude d'un grand nombre d'individus dans une région limitée du génome grâce à la capacité haut-débit du MALDI-TOF MS. Cette méthode, rapide et efficace, possède de nombreuses applications tel que: le génotypage, le génotypage allèle-spécifique en multiplex, le microhaplotypage en multiplex, l'analyse de la méthylation de l'ADN et le séquençage