Développement de méthodes chromatographiques liquides multidimensionnelles couplées à la spectrométrie de masse, préparation et analyse d'échantillons biologiques complexes.

• Main Author: Delmotte, Nathanaël
• Language: ENG
• Published: Université Louis Pasteur - Strasbourg I 2007
• Subjects: [CHIM:OTHE] Chemical Sciences/Other; Analyse protéomique; biomarqueur; chromatographie d'affinité; chromatographie liquide<br />multidimensionnelle; CIM; colonne monolithique; colonne d'enrichissement; <br />complémentarité; Corynebacterium glutamicum; couplage; hémoglobine; hémolysat; micro-<br />HPLC; NT-proBNP; orthogonalité; RAM; répétabilité; sérum; spectrométrie de masse
• Online Access: http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00193714; http://tel.archives-ouvertes.fr/docs/00/19/37/14/PDF/Delmotte_These.pdf

Des immunoadsorbeurs ont été développés à partir de disques CIM monolithiques pour l'analyse de biomarqueurs impliqués dans des maladies cardio-vasculaires. Les colonnes développées ont permis d'isoler sélectivement la myoglobine et le NT-proBNP du sérum humain. Les colonnes anti-NT-proBNP ont permis l'isolation quantitative du NT-proBNP (R2=0,998) à des concentrations jusqu'à 750 amol/μL de sérum.<br />Six matériaux à accès restreints ont été évalués en fonction de leur aptitude à exclure l'hémoglobine d'hémolysats sanguins. Des injections à différents pH ont montré que la rétention de l'hémoglobine est drastiquement restreinte à pH 10,7. En raison d'une bonne stabilité à pH basique, la colonne polymérique Biotrap 500 MS RAM a été retenue pour l'extraction d'antibiotiques d'hémolysats sanguins. Des extractions quantitatives d'analytes à faibles concentrations (200 pg/μL) ont été réalisées sans effet mémoire d'hémoglobine sur la colonne.<br />Un nouveau système 2D-HPLC-ESI-MS/MS pour l'analyse protéomique a été développé. Le système est composé d'une séparation par RP-HPLC à pH 10,0, suivie d'une séparation par IP-RP-HPLC à pH 2,1. Ce nouveau système a été comparé à un système conventionnel SCX x IP-RP-HPLC. L'orthogonalité des méthodes de séparation est plus élevée dans l'approche SCX x IP-RP-HPLC que dans le schéma RP x IP-RP-HPLC. Cependant, en raison d'une meilleure distribution des peptides et d'une meilleure efficacité de séparation, le système RP x IP-RP-HPLC permet d'identifier significativement plus de peptides. Les deux approches sont complémentaires et une combinaison des deux systèmes permet d'identifier plus de peptides que des analyses répétées par un système unique.