Isolation and characterization of three distinct forms of lipases from Candida rugosa produced in solid state fermentation

• Main Authors: Sailas Benjamin, Ashok Pandey
• Format: Article
• Language: English
• Published: Instituto de Tecnologia do Paraná (Tecpar) 2001-06-01
• Series: Brazilian Archives of Biology and Technology
• Subjects: Candida rugosa; lipases; solid cultures; purification; characterization
• Online Access: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-89132001000200016

Three distinct forms (Lip A, Lip B and Lip C) of extra-cellular lipases (EC- 3.1.1.3), produced by Candida rugosa in solid state fermentation (SSF) were purified and characterised. SSF was carried out in glass columns using coconut oil cake and wheat bran. The enzyme was purified from the aqueous extract of fermented matter by ammonium sulphate precipitation, dialysis, ultra-filtration and gel filtration using Sephadex-200 to a 43-fold purification and 64.35-mg/ml specific activity. SDS-PAGE of purified enzyme revealed three distinct bands, indicating the existence of three iso-forms, Lip A, Lip B and Lip C with apparent molecular weight about 64,000, 62,000 and 60,000 Da, respectively. All the three iso-forms were optimally active at 35-40°C and pH 7-8. They showed marked differences in their Km values with different saturated and unsaturated triacyl glycerols. Ag++ and Hg++ strongly inhibited enzyme activity of all the iso-forms, Mn++ has no effect and Ca++ and Mg++ enhanced the activity. EDTA also strongly inhibited the enzyme activities of iso-forms. However, activities of all the three lipases were completely inhibited by serine protease inhibitors such as 3,4-dichloroisocoumarin, pefabloc and partially by phenylmethanesulphonyl fluoride. To the best of our knowledge, this is the first report describing the purification and characterisation of C. rugosa lipase iso-forms from solid cultures. These lipase iso-forms with diverse characteristics produced in solid cultures may find potential application in biomedical field.<br>Três formas distintas (Lip A, Lip B e Lip C) de lipases extracelulares (EC - 3.1.1.3), produzidas por Candida rugosa em fermentação no estado sólido (SSF) foram purificadas e caracterizadas. SSF foi conduzida em colunas de vidro, utilizando torta de óleo de coco e farelo de trigo. A enzima foi purificada do extrato aquoso do material fermentado por precipitação com sulfato de amônio, diálise, ultra - filtração e filtração em gel com Sephadex - 200 para uma purificação de 43 vezes e 64.35 - mg / ml de atividade específica. SDS - PAGE da enzima purificada revelou três faixas distintas, enquanto indicando a existência de três formas isômeras, Lip A, Lip B e Lip C com peso molecular aparente de aproximadamente 64,000, 62,000 e 60,000 Da, respectivamente. Todos as três formas isômeras eram ativas opticamente a 35-40ºC e pH 7-8. Elas mostraram diferenças marcantes nos valores de Km com diferentes triacilgliceróis saturados e insaturados. Ag + + e Hg + + inibiram fortemente a atividade enzimática de todas as três formas isômeras, Mn + + não produziu efeito e Ca + + e Mg + + aumentaram a atividade. EDTA inibiu fortemente as atividades enzimáticas dos isômeros. Porém, atividades de todas as três lipases eram completamente inibidas por inibidores de protease serina como 3,4 - dicloroisocomarina, pefabloc e parcialmente através de fluoreto de fenilmetanesulfonil. Este é o primeiro relatório que descreve a purificação e caracterização de lipases isoméricas produzidas por C. rugosa em culturas sólidas. Estes isômeros de lipase com características diversas produzidas em culturas sólidas podem obter aplicação potencial em campo biomédico.