Aislamiento y purificación del virus X de la papa y clonación del gen de su cubierta proteica

• Main Authors: L. Duplat, O. Acosta, J. Peñaranda, M. Caro
• Format: Article
• Language: Spanish
• Published: Universidad Nacional de Colombia 2001-01-01
• Series: Revista Colombiana de Biotecnología
• Subjects: Virus X de la papa; clonación; cubierta proteica; reacción en cadena de la polimerasa
• Online Access: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/30063
• ISSN: 0123-3475; 1909-8758

El objetivo principal de este trabajo fue obtener clones del gen que codifica la cubierta proteica (CP) del virus X de la papa (PVX). Para lograrlo se estudió un aislamiento colombiano del PVX obtenido de muestras de plantas de papa recolectadas en el páramo de San Jorge (CORPOICA). Después de la inoculación sobre Datura stramonium, se tomó una lesión local producida sobre este hospedero y se inocul ó sobre Nicotiana tabacum, de cuyo tejido se purificó el PVX. El RNA genómico extraído de las partículas virales purificadas presentó un tamaño de aproximadamente 6 Kb. La síntesis del cDNA, utilizando el primer 4DT/KPN, se evidenció mediante la incorporación de Digoxigenina. La amplificación por PCR del gen CP, a partir del cDNA sintetizado, se realizó utilizando el primer OX6 junto con el primer LK/pn, complementario a la secuencia del extremo 5´ del primer 4DT/KPN. El producto de la amplificación presentó el tamaño esperado de aproximadamente 870 pb, en adición a otros productos de 600-123 pb. Estos fragmentos amplificados fueron clonados en el plásmido pMOSBlue. Los recombinantes fueron analizados en “minipreps”, digiriendo el plásmido con Sma I y Hind III o utilizando el método de amplificación con PCR directamente de la colonia. Las colonias transformadas con el inserto apropiado fueron almacenadas en glicerol a -70 °C.